Nonlinear imaging of molecular organization in 3D in biological media

Imagerie non-linéaire de l'organisation moléculaire en 3D dans les milieux biologiques La microscopie polarimétrique par fluorescence et génération de seconde harmonique est une technique utile pour obtenir des données multidimensionnelles sur des échantillons biologiques au niveau moléculaire. Pour les molécules fluorescentes liées de manière rigide à des biomolécules structurelles plus grandes, telles que les sondes lipidiques orientées et les structures fibreuses des protéines, la mesure de l'orientation de l'étiquette fluorescente peut rendre compte de la structure biologique sous-jacente. Ces marqueurs d'orientation, lorsqu'ils sont mesurés dans un ensemble localisé au foyer du microscope, ont une émission polarisée anisotrope due à leur orientation dipolaire. De même, les sous-unités protéiques répétitives dans les fibres de collagène ont un dipôle induit par deux photons (génération de seconde harmonique) sensible à l'orientation de ces sous-unités. L'absorption à deux photons pour les sondes fluorescentes permet d'améliorer la résolution axiale pour l'imagerie 3D, ainsi que de réduire la diffusion des grandes longueurs d'onde dans les tissus plus épais. Ces avantages de la microscopie à deux photons étaient intéressants pour mettre en œuvre une nouvelle méthode de détection polarisée pour mesurer l'orientation moléculaire. La plupart des techniques polarisées produisent une projection 2D de l'orientation moléculaire 3D dans l'échantillon, ce qui introduit des biais dans les lectures d'orientation résultantes. Cette thèse applique un concept de mesure de l'orientation dipolaire 3D d'une molécule unique à des mesures d'ensemble avec excitation à 2 photons dans un microscope à balayage laser. Tout d'abord, je démontre la théorie transposable d'une détection simultanée de 4 polarisations émises avec un filtrage d'intensité sur 2 de ces polarisations de la technique de molécule unique à l'ensemble à un dipôle excité par TPF ou SHG. J'examine les biais dans les différents calculs de géométrie d'illumination, ainsi que les effets du bruit de Poisson de la détection sur le calcul de l'orientation moléculaire. Ensuite, j'ai construit un microscope modulaire à 2 photons et discute des défis de l'étalonnage des composants sensibles à la polarisation à une variété de longueurs d'onde. Je démontre ensuite l'imagerie d'orientation moléculaire 3D de sondes d'orientation fluorescentes dans des membranes lipidiques dans des membranes modèles et des cellules vivantes, ainsi que liées à la F-actine dans des cellules en culture cellulaire 2D et 3D. Enfin, je montre une mesure sans marquage de l'orientation 3D des sous-unités moléculaires du collagène en utilisant l'imagerie SHG 4polaire. Les applications potentielles de cette nouvelle technique 4polaire couplée à des mesures d'ensemble multiphotoniques sont l'obtention d'informations moléculaires dans des échantillons biologiques 3D tels que la structure du collagène dans les tissus, l'hétérogénéité des membranes lipidiques dans la culture cellulaire 3D, et l'interrogation des rôles de l'actine pour les cellules interagissant avec un environnement 3D