The role of Lck inhibition on lymphocyte function

Η ειδική λεμφοκυτταρική τυροσινική κινάση-Lck είναι μέλος της εξελικτικά συντηρημένης οικογένειας των Src κινασών (SFK) και εκφράζεται κυρίως στα Τ λεμφοκύτταρα. Η Lck είναι υπεύθυνη για την διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, λόγω του καίριου ρόλου της στην επαγωγή της Τ κυτταρικής σηματοδότησης μετά την πρόσδεση ενός αντιγόνου από τον Τ κυτταρικό υποδοχέα που έχουν στην επιφάνεια τους. Βασιζόμενη στο ουσιαστικό ρόλο που έχει στα κύτταρα αυτά, η Lck εμπλέκεται σε ποικίλες Τ παρεκτρεπόμενες αποκρίσεις, όπως είναι η αυτοανοσία, οι λευχαιμίες, η νόσος μοσχεύματος έναντι του ξενιστή και στην εμφάνιση τοξικότητας από ανοσοθεραπείες που χρησιμοποιούν CAR-T λεμφοκύτταρα. Λόγω της σημασίας που έχει η Lck στα Τ λεμφοκύτταρα, η κινάση αυτή έχει αποτελέσει ελκυστικό στόχο για την ανάπτυξη μικρών μορίων αναστολέων. Ωστόσο ο σχεδιασμός τέτοιων αναστολέων είναι εξαιρετικά δύσκολος, καθώς οι μέχρι τώρα διαθέσιμοι αναστολείς έχουν ιδιαίτερα χαμηλή ειδικότητα. Το κύριο εμπόδιο είναι η αξιοσημείωτη ομολογία που παρουσιάζουν οι Src κινάσες στα καταλυτικά τους κέντρα, κάνοντας την δημιουργία ειδικών Lck αναστολέων εξαιρετικά απαιτητική. Πρόσφατες έρευνες από το δικό μας και άλλα εργαστήρια έχουν εντοπίσει ότι η SH4 περιοχή της Lck (LckSH4), η οποία βρίσκεται εκτός του καταλυτικού κέντρου της κινάσης, είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση της Lck στην πλασματική μεμβράνη των Τ λεμφοκυττάρων, πρόσδεση η οποία είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της κινάσης. Αξιοσημείωτο είναι επίσης το γεγονός ότι η LckSH4 περιοχή παρουσιάζει ελάχιστη ομολογία με αντίστοιχες περιοχές άλλων Src κινασών, κάνοντας την ιδανικό στόχο για την επιλεκτική αναστολή της Lck. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η αποτελεσματική και επιλεκτική αναστολή της Lck, στοχεύοντας την LckSH4 περιοχή με σκοπό την παρεμπόδιση της αγκυροβόλησης της Lck στην πλασματική μεμβράνη των κυττάρων και κατά συνέπειά την μείωση της ενζυμικής ενεργότητας της κινάσης. Η στόχευση αυτή θα επιτευχθεί με την χρήση νανοαντισωμάτων έναντι της LckSH4 περιοχής (anti-LckSH4 Nbs). Τα νανοαντισώματα (Nbs) είναι μια ειδική κατηγορία μικρών, γενετικά τροποποιημένων αντισωμάτων που απαντώνται στα καμηλοειδή και αποτελούνται αποκλειστικά από μία μεταβλητή περιοχή βαριάς αλύσου (VHH), περιοχή η οποία είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση σε ένα επίτοπο. Τα τελευταία χρόνια τα Nbs έχουν χαρακτηριστεί ως «ανερχόμενα αστέρια» στο κόσμο των αντισωμάτων, κατέχοντας κεντρική θέση στην καινοτόμα εφαρμοσμένη βιοϊατρική έρευνα και ιδιαίτερα στο τομέα της διάγνωσης και της θεραπείας ασθενειών. Λόγω των μοναδικών δομικών χαρακτηριστικών και ιδιοτήτων τους, τα Nbs αναμένονται να αντικαταστήσουν γρήγορα τα συμβατικά μονοκλωνικά αντισώματα ως θεραπευτικά και διαγνωστικά εργαλεία. Στην παρούσα μελέτη 30 διαφορετικά anti-LckSH4 Nbs δοκιμάστηκαν για την ικανότητα τους να προσδέσουν την Lck ενδοκυτταρικά. Τα αρχικά αποτελέσματα έδειξαν ότι τα Nbs εντοπίζονταν κυρίως σε ενδοκυττάρια διαμερίσματα διαφορετικά από αυτά που βρίσκεται η Lck, αποτρέποντας την αποτελεσματική πρόσδεση της Lck από τα Nbs. Προκειμένου να αντιμετωπίσουμε αυτό το πρόβλημα, εισαγάγαμε διάφορες τροποποιήσεις στο αμινοτελικό άκρο των Nbs, με στόχο να αυξηθεί ο συνεντοπισμός μεταξύ της κινάσης και των Nbs, αυξάνοντας με την σειρά του τις πιθανότητες επιτυχούς δέσμευσης της Lck. Η επιλογή του καλύτερου Nb ως δεσμευτή της Lck, έγινε κατόπιν ελέγχου της ικανότητας των αμινοτελικών τροποποιήσεων να κατευθύνουν τα Nbs στα ίδια ενδοκυττάρια διαμερίσματα με την Lck καθώς και της ικανότητας των Nbs να προσδένουν την Lck. Επιπρόσθετα, αξιολογήθηκε η ικανότητα των Nbs να μειώνουν την ενεργότητα της κινάσης και να αναστέλλουν την Lck-επαγόμενη Τ κυτταρική σηματοδότηση. Παρά το γεγονός ότι η πλειοψηφία των αμινοτελικών τροποποιήσεων κατηύθυνε τα Nbs στα ίδια ενδοκυττάρια διαμερίσματα στα οποία βρίσκεται η Lck, μόνο μία τροποποίηση, η προσθήκη της SH4 περιοχής της Lck στο NbGT (Lck-NbGT) οδήγησε στην αποτελεσματική πρόσδεση της Lck. Σε αντίθεση, οι άλλες τροποποιήσεις στα Nbs παρουσίασαν ελάχιστη έως μηδαμινή πρόσδεση στην κινάση. Παράλληλα, το Lck-NbGT είναι ιδιαίτερα επιλεκτικό έναντι της Lck, καθώς δεν είχε την ικανότητα πρόσδεσης χιμαιρικών μορφών της Lck, στις οποίες η LckSH4 αντικαταστάθηκε από τις αντίστοιχες άλλων Src κινασών, ούτε παρεμπόδισε την επαγωγή της ενδοκυττάριας σηματοδότησης στα Β λεμφοκύτταρα, τα οποία εκφράζουν ενδογενώς μια άλλη Src κινάση, την Lyn και όχι την Lck. Παρόλο που η αρχική υπόθεση εργασίας, δηλαδή η στόχευση της LckSH4 περιοχής από τα Nbs θα απωλέσει την ενζυμική ενεργότητα της κινάσης, δεν μπόρεσε να επαληθευτεί, έγινε δυνατή η έρευση ενός αποτελεσματικού και ειδικού προσδέτη της LCK, ο οποίος στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τη επιλεκτική αποικοδόμηση της κινάσης. Πιο συγκεκριμένα, επαναπροσδιορίσαμε την χρήση του Lck-NbGT ως επαγωγέα αποικοδόμησης της Lck, χρησιμοποιώντας το σύστημα του πρωτεασώματος. Πιο αναλυτικά, το Lck-NbGT ενώθηκε με τη Ε3 λιγάση ουβικουιτίνης RNF4, με σκοπό την πρόσδεση της Lck από το Lck-NbGT και την αποικοδόμηση της από το πρωτεάσωμα. Αυτό το καινούργιο είδος anti-LckSH4 Nb έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα, καθώς η μείωση των επιπέδων της Lck ήταν ιδιαίτερα σημαντική. Τέλος, συγκεντρωτικά δεδομένα από συνεστιακή μικροσκοπία και πειράματα ανοσοκατακρίμνισης κατέδειξαν ότι το NbGT μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ειδικός, μη επεμβατικός και υψηλής ανάλυσης ανιχνευτής της Lck, ικανός να εντοπίζει την φυσική τοποθεσία της κινάσης με υψηλή ακρίβεια. Με βάση αυτά τα δεδομένα, προτείνουμε την ευρύτερη χρήση των Nbs ως ένα νέο βιοχημικό εργαλείο για τον προσδιορισμό του ενδοκυτταρικού εντοπισμού των μορίων-στόχων με ανώτερη ανάλυση από αυτή που παρέχεται από τις συμβατικές τεχνικές απεικόνισης.