Séquençage nanopore d'isolats de poliovirus v1

ABSTRAIT Ce protocole est adapté du protocole "Détection directe du poliovirus par séquençage nanopore - les échantillons de selles" pour le rendre adapté à une utilisation avec des isolats sous forme liquide ou qui ont été transportés au laboratoire via une carte FTA. Le protocole vise à amplifier la région VP1 du poliovirus avec une seule PCR à l'aide defs amorces Q8/Y7. Nous utilisons des amorces à code-barres car cela simplifie grandement le processus ultérieur de préparation de la bibliothèque. Les séquences d'amorces pour les amorces Q8/Y7 à code-barres se trouvent dans le base de données S1 de Shaw et al (2020). Ce protocole devrait être utilisé avec les réactifs de séquençage chimique Oxford Nanopore kit14 et le séquenceur MinION Mk1B, MinION Mk1C ou GridION. Dans les étapes du protocole, des contrôles de qualité sont inclus et suivent le flux de travail défini dans le document « Quality Control and Data Recording for DDNS ». AVANT DE COMMENCER Ce protocole décrit l’amplification de la séquence VP1 et la préparation de la bibliothèque pour le séquençage. Nous prévoyons que les utilisateurs auront effectué une extraction d'ARN avant ce protocole pour extraire l'ARN du poliovirus. Nous recommandons le kit "MagMAX Viral RNA Isolation" pour ce processus. Amorces VP1 à code-barres: Pour permettre un protocole simplifié, nous utilisons une plaque d’amorce à 96 puits avec 5 µM d’amorce Y7 à code-barres et 5 µM d’amorce Q8 à code-barres dans chaque puit. Chaque puit contient des amorces Q8 et Y7 avec le même code-barres unique, par exemple A1 = Y7 avec code-barres 1 et Q8 avec code-barres 1, A2 = Y7 avec code-barres 2 et Q8 avec code-barres 2, etc. Ces amorces peuvent être commandées prémélangées ou sous forme de deux plaques distinctes qui doit être mélangées au laboratoire.