Identification and modification of amine dehydrogenases by genomic and structural approaches for biocatalytic amine synthesis

Identification et modification d'amine déshydrogénases par approches génomique et structurale pour la synthèse biocatalysée d'amines Pour faire face à la forte demande en amines des industries pharmaceutiques, agrochimiques et plus généralement des industries de chimie fine et de gros tonnages, de nouveaux procédés durables de synthèse d'amines doivent être développés en prenant en compte les challenges économiques et environnementaux actuels. La biocatalyse, qui consiste en l'utilisation d'enzymes pour la synthèse, représente une alternative plus verte aux procédés chimiques conventionnels. Elle permet de travailler de manière catalytique dans des conditions douces et généralement dans des temps réactionnels plus court grâce à la chimio et stereosélectivité des enzymes. D'abord centrées autour des lipases et des transaminases, les solutions biocatalytiques pour la synthèse d'amines se sont étendues dans les années 2010 avec la découverte d'enzymes catalysant l'amination réductrice de composés carbonylés. Ces solutions comprennent plusieurs familles telles que les opine déshydrogénases, les imine réductases, les réductive aminases (RedAms) et les amine déshydrogénases (AmDHs). Ces dernières étaient restreintes aux acide aminé déshydrogénases ingénierées jusqu'à la découverte d'enzymes natives (nat-AmDHs) catalysant la formation de l'imine en présence d'ammoniac et sa réduction par un cofacteur NAD(P)H. Elles favorisent la formation de l'amine (S), rarement décrit dans d'autres familles d'enzymes catalysant la même réaction. La famille des nat-AmDHs s'est étendue grâce à plusieurs cycles d'exploration de (méta)génomes mais manquait encore de diversité de séquences. Les recherches présentées cherchent à apporter cette diversité manquante par des approches basées sur des analyses in silico de modèles par homologie ou structures crystallographiques, obtenues grâce à un travail collaboratif extérieur. Une analyse structurale poussée de la famille couplée à un travail d'ingénierie protéique a révélé l'importance de certains résidus du site actif. La caractérisation de quelques nat-AmDHs a montré leur activité sur des substrats encore peu étudiés tels que des petits aldéhydes aromatiques ou cétones hydroxylées. Plusieurs approches ont été utilisées pour étendre le spectre de substrats des nat-AmDHs restreints aux petits composés carbonylés (<C6). La première a permis l'identification in silico de deux résidus encombrants et conservés au sein de la famille, considérés comme des cibles pour l'agrandissement du site actif. Ces deux résidus ont été mutés dans dix nat-AmDHs possédant une structure similaire mais des sites actifs différents. La majorité des mutants se sont révélés actifs sur des substrats encore non atteints tels que les aldéhydes de hexanal (jusqu'à 99.5% de conversion non optimisée) à nonanal (44.5%), les cétones de hexan-2-one (39.5%) à nonan-2-one (16%) et la 4-phenylbutan-2-one (52.5%), en conservant leur forte (S)-enantiosélectivité (> 90% ee). Le meilleur mutant CfusAmDH-W145A a été utilisé pour la synthèse d'environ 100mg de (2S)-octan-2-amine et heptan-1-amine. Une autre approche d'évolution in vivo en continu, utilisant les automates de culture du Genoscope, a été tentée pour l'amélioration des activités de certaines nat-AmDHs et d'AspRedAm. Les deux sélections se basaient sur l'activité de déamination oxidative de ces enzymes qui s'est révélé hypothétiquement trop faible pour permettre une croissance cellulaire suffisante pour permettre une évolution. Dans le cadre du projet MODAMDH cherchant à trouver plus de diversité de séquences AmDH, la famille a été drastiquement étendue de 2011 à 17039 membres. En se basant sur les analyses structurales et résultats expérimentaux obtenus, une sélection de 92 enzymes possédant des caractéristiques particulières a été faite. Grâce à ce travail, nous avons une vue et une compréhension quasi complètes de la diversité des nat-AmDHs ce qui aidera à leur amélioration et à leur application en synthèse.