Joint X-ray and neutron crystallography methods for the study of enzymatic reactions

Méthodes de cristallographie communes par rayons X et neutrons pour l'étude de réactions enzymatiques L'importance des techniques de diffraction aux rayons-X pour la détermination de structures macromoléculaires en rapport à la fonction biologique peut être facilement comprise lorsque l'on regarde le nombre de dépôts dans la « Protein Data Bank » (http://www.rcsb.org/pdb). Bien que plus de 100.000 structures aux rayons-X soit actuellement dans la base de données, l'étude des macromolécules biologiques avec des techniques de diffraction aux neutrons a été bien plus limitée. Toutefois, les études qui ont été effectuées, illustrent clairement que la cristallographie moléculaire des neutrons peut fournir d'importante informations complémentaires à celles acquises lors d'études aux rayons-X. En effet, des développements majeurs ont eu lieu récemment à la fois sur la préparation des échantillons (notamment les techniques de deutération) ainsi que sur l'instrumentation.Ce travail décrit l'application de techniques qui mettent en œuvre deux procédés de diffraction des neutrons et des rayons-X. En particulier, l'utilisation de la cristallographie des neutrons et l'analyse spectroscopique in crystallo appliqué sur des cibles biologiques sélectionnées est développé pour un certain nombre de systèmes clés. L'optimisation de protocoles et le développement de nouveaux outils ont été exploré, afin d'effectuer conjointement de la cristallographie macromoléculaire à haute résolution aux neutrons et aux rayons X. Dans ce contexte, un nouveau système de montage cristallographique, totalement compatible avec les techniques de diffraction aux neutrons et aux rayons X, a été développé dans le but de réaliser les expériences souhaitées.La spectroscopie UV-vis et Raman in crystallo ont été utilisées pour contrôler la formation d'un produit de réaction directement dans les cristaux. Certaines méthodologie sur la congélation ainsi que sur la croissance de grand cristaux ont été effectuée afin d'acquérir suffisamment de données pour établir un protocole qui pourrait être appliquée en routine pour des expériences de diffraction de neutrons cryogéniques. Les méthodes et la technologie développée à l'intérieur de ce projet ont conduit à la détermination d'une structure cristalline aux neutrons de la trypsine en complexe avec son substrat, le Suc-RRMA-PNA, les collectes de données ont été effectuée à température cryogénique.En outre, nous avons concentrés notre attention sur deux enzymes spécifiques impliquées dans la production de tréhalose dans le microorganisme Deinococcus radiodurans – la maltooligosyltrehalose trehalosynthase (MTSase) et la maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MTHase). Ces deux enzymes sont capables de dégrader l'amidon soluble et les polysaccharides linéaires en trehalose, qui est un disaccharide connu pour ses propriétés protectrices des protéines et des membranes cellulaires. Dr-MTSase catalyse une transglycosylation intramoléculaire afin de transformer le maltopentaose en maltotriosyltréhalose, tandis que la Dr-MTHase reconnaît et clive spécifiquement les substrats maltotriosyltréhalose afin de libérer le tréhalose. La nouvelle structure de la Dr-MTSase a été déterminée dans sa forme apo et en complexe avec différents substrats de sucre; en outre, la caractérisation enzymatique et une description de son mécanisme de réaction sont rapportés. Enfin, la croissance de gros cristaux perdeutéré et l'analyse spectroscopique de la liaison du Dr-MTHase en complexe avec son substrat, le maltopentaose, ont été réalisés en vue d'une prochaine expérience de diffraction des neutrons.