Phylogenomics & Molecular studies of Lhr-type SF2 helicases in Archaea and Bacteria

Etudes phylogénomiques et moléculaires des hélicases de type Lhr chez les Archaea et les bactéries Les hélicases, classées en six superfamilles (SF1-6), sont des protéines qui utilisent l'énergie de l'ATP pour dérouler les acides nucléiques et pour remodeler les complexes protéines-acides nucléiques. Elles sont impliquées dans presque tous les aspects du métabolisme de l'ADN et de l'ARN en participant à de nombreux mécanismes de maintien de l'intégrité cellulaire. Les protéines de type Lhr sont des hélicases SF2 qui sont pour la plupart non caractérisées. Récemment, par des approches phylogénomiques, Dr H. Chamieh et ses collaborateurs ont classé toutes les hélicases SF1 et SF2 présentes dans les génomes d'Archaea et ont montré que les protéines de type Lhr sont ubiquitaires (Chamieh et al. 2016). De plus, en déterminant les réseaux d'interaction des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN, comme la ribonucléase aRNase J et l'hélicase ASH-Ski2, Dr B. Clouet-d'Orval et ses collaborateurs ont identifié un lien entre les machines de traduction, de dégradation de l'ARN et de transcription chez les Thermococcales -archaea hyperthermophile- avec, au sein de ces réseaux, une protéine annotée comme une hélicase de type Lhr (Phung et al. 2020). Dans ce contexte, les travaux de ma thèse ont pour objectif d'effectuer des analyses phylogénomiques approfondies des hélicases de type Lhr chez les archées et les bactéries, de disséquer la fonction moléculaire de aLhr2 chez Thermococcus barophilus, organisme modèle pour les études biochimiques et génétiques chez les Thermococcales, et d'étudier le rôle de l'hélicase Lhr de E. coli où le gène lhr est en opéron avec le gène codant pour la RNase T. Dans une première partie, une étude bibliographique (publication d'un chapitre de livre ; Hajj et al, 2019) et des analyses phylogénomiques ont permis de définir les protéines de type Lhr comme ubiquitaire chez les archées et d'identifier cinq groupes d'orthologues. Ces analyses permettent de proposer un chemin évolutif pour les protéines Lhr d'archées et de bactéries et d'émettre des hypothèses sur leurs fonctions dans la cellule (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur l'étude moléculaire de aLhr2 de Thermococcus barophilus (Tbar). Pour étudier les activités enzymatiques de Tbar-aLhr2, le gène alhr2 a été cloné et la protéine recombinante Tbar-aLhr2 exprimée à l'aide du système d'expression pET chez E. coli. Nous avons démontré que Tbar-aLhr2 est une ATPase avec une affinité similaire pour l'ADN et l'ARN simple brin qui peut spécifiquement former et dérouler des duplex ADN/ARN avec une extrémité 3' sortante. Enfin, nous avons effectué des analyses protéomiques et transcriptomiques pour identifier le réseau de protéines associées à Tbar-aLhr2 et pour déterminer l'impact de la délétion du gène alhr2 (Δalhr2) sur l'expression génique chez T. barophilus. Au regard de ces résultats, nous proposons que Tbar-aLhr2 est impliqué au niveau de la transcription et/ou de la réparation de l'ADN chez les Thermococcales en agissant au niveau des "R-loop" (duplex ARN/ADN) (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une troisième partie, nous avons initié une étude fonctionnelle de l'hélicase bLhr de E. coli (Eco). Pour tester l'interaction entre Eco-bLhr et la RNase T qui sont exprimées au sein d'un même opéron, le gène Eco-blhr a été cloné et la protéine recombinante Eco-bLhr exprimée. La RNase T est une ribonucléase connue pour être impliquée dans la réparation de l'ADN et le métabolisme des ARNt et ARNr. Finalement, une discussion permet de comparer le(s) rôle(s) proposé(s) pour les hélicases de type Lhr chez les bactéries et les archées en dégageant l'ARN comme acteur clé dans la réparation des dommages de l'ADN.