CRISPR-Cas9-based strategies for enhanced targeted integration

Stratégies basées sur CRISPR-Cas9 visant à optimiser l'intégration ciblée La transplantation de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSPH) corrigées autologues est une stratégie prometteuse pour traiter les troubles génétiques sanguins, immunitaires et métaboliques en raison de leur capacité d'autorenouvellement et de différenciation en cellules sanguines variées. Une des méthodes les plus utilisées pour modifier les CSPH repose sur les outils d'édition de gènes comme les nucléases CRISPR/Cas9. L'intégration ciblée via CRISPR-Cas9 permet l'insertion précise de séquences thérapeutiques, offrant une source durable de cellules corrigées La cassure double brin (CDB) induite par Cas9 peut être réparée par trois voies principales : La jonction d'extrémités non homologues (NHEJ), où les brins libres générés sont ré-ligaturés, ou la recombinaison homologue dirigée (HDR) et la jonction d'extrémités médiée par microhomologie (MMEJ), qui utilise un modèle d'ADN pour la réparation. En fournissant un modèle d'ADN externe, la HDR et la MMEJ peuvent être détournées pour insérer des séquences curatives. Une plateforme de thérapie génique a été développée, avec des locus de refuge comme AAVS1 et HBA. Le locus HBA, en raison de sa forte expression d'α-globine et de sa perte de gène asymptomatique, est particulièrement prometteur pour l'expression de protéines thérapeutiques dans les cellules érythroïdes. Cependant, cette approche prometteuse soulève d'importants défis quant à l'amélioration et à l'évaluation de son efficacité et de sa sécurité.Pour aborder ces défis, divers aspects de l'intégration ciblée basée sur CRISPR/Cas9 ont été étudiés, notamment l'optimisation des méthodes d'administration du modèle ADN, la réduction de la toxicité cellulaire et l'exploitation des voies de réparation pour maximiser l'efficacité de l'intégration.L'un des principaux domaines d'investigation a porté sur la sélection et l'optimisation des méthodes d'administration pour l'introduction de modèles donneurs dans les cellules cibles. Les méthodes d'administration non virales et virales ont été explorées, l'AAV6 et l'IDLV se révélant les plus prometteuses.La toxicité cellulaire, souvent déclenchée par les outils d'intégration ciblée comme l'AAV et CRISPR/Cas9, diminue la viabilité cellulaire en activant la réponse aux dommages de l'ADN, affectant ainsi la capacité de greffe des CSPH. Pour atténuer ces effets génotoxiques, des protocoles visant à réduire la toxicité tout en atteignant des taux suffisants d'intégration ciblée ont été explorés.Les voies de réparation basées sur l'homologie, nécessaires à l'intégration des cassettes, sont limitées à des phases spécifiques du cycle cellulaire. La MMEJ opère pendant les phases G1/S, tandis que la HDR se produit pendant les phases S/G2. La NHEJ, active tout au long du cycle cellulaire, est responsable de la plupart des inconvénients de CRISPR, notamment les aberrations chromosomiques post-CDB.Pour favoriser l'utilisation de la HDR et de la MMEJ, un inhibiteur de la NHEJ a été testé, entraînant une augmentation significative de l'efficacité de l'intégration ciblée avec l'AAV et l'IDLV. Avec l'AAV6 identifié comme méthode optimale d'administration et l'inhibition de la NHEJ comme moyen d'améliorer l'intégration ciblée, la sécurité de la stratégie au niveau du site ciblé a été évaluée. En utilisant le séquençage ciblé à lecture longue, la caractérisation et la quantification des altérations génomiques induites par CRISPR/Cas9 et des événements d'intégration ciblée ont été réalisées, démontrant ainsi l'amélioration de la sécurité de notre approche.Ces résultats mettent en évidence le potentiel de l'inhibition de la NHEJ comme stratégie prometteuse pour améliorer l'édition du génome et l'intégration ciblée de l'ADN.