Étude de la maturation des ARN de transfert par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

Les ARN de transfert (ARNt) sont initialement transcrits sous forme de précurseurs qui doivent être maturés pour devenir fonctionnels. Ce processus de maturation comprend le processing des extrémités 5' et 3', l'ajout de la séquence CCA à l'extrémité 3', l'épissage de l'intron lorsqu'il est présent, et l'incorporation de modifications post-transcriptionnelles. Ces modifications participent à la structure, la stabilité et globalement au bon fonctionnement des ARNt. Parmi ces modifications, la modification N1-méthyladénosine (m1A) est une modification fréquemment rencontrée à différentes positions dans les ARNt de tous les règnes du vivant. L'incorporation des modifications post-transcriptionnelles peut être suivie à par résonance magnétique nucléaire (RMN) en extraits cellulaires. Cette approche novatrice, développée sur l'ARNt phénylalanine de Saccharomyces cerevisiae (ARNtPhe) a permis de révéler que les modifications post-transcriptionnelles dans la région centrale des ARNt sont introduites dans un ordre chronologique défini, avec des circuits de modifications qui contrôlent notamment l'incorporation de la modification m1A58 dans l'ARNtPhe. La première partie de ma thèse a consisté à développer la RMN en extrait pour pouvoir étudier l'épissage de l'intron et l'incorporation des modifications post-transcriptionnelles de l'ARNtPhe de levure contenant un intron. En utilisant la RMN pour suivre la maturation de cet ARN dans un extrait de levure actif pour l'épissage d'introns et les modifications, nous avons montré que les modifications dans la région centrale de l'ARNt (Ψ55, m5C49, T54, D16, m7G46, m22G26, m5C40, m1A58) sont incorporées avant l'épissage de l'intron. La présence d'un intron allonge le temps de maturation, permet l'incorporation des modifications m5C40 et m22G26, et change l'ordre d'incorporation des modifications m2G10 et m22G26 dans le bras D. La chronologie des événements de maturation est cohérente avec la localisation des enzymes de maturation dans la levure. Cette étude ouvre la voie à de futures recherches sur les processus de maturation des ARNt chez les eucaryotes. La deuxième partie de ma thèse se concentre sur la modification m1A22 chez Bacillus subtilis. Cette modification, incorporée par l'enzyme TrmK, est trouvée uniquement chez les bactéries Gram +. Le gène trmk a été conservé au cours de l'évolution et est même essentielle pour certaines bactéries pathogènes. J'ai étudié l'incorporation de cette modification dans l'ARNt glutamate de Bacillus subtilis, l'organisme modèle des Gram+. La signature RMN de cette modification a été déterminée ainsi que l'ordre d'incorporation des modifications de cet ARNt. Contrairement à la modification m1A58 dans les ARNt de levure, aucun circuit de modification impliquant la modification m1A22 n'a été observé, suggérant un mécanisme de d'incorporation différent de cette modification en position 22. La dernière partie concerne une étude préparatoire visant à mettre en œuvre la technique RMN pour observer l'incorporation des modifications dans des cellules vivantes, en utilisant les ovocytes de Xenopus laevis comme modèle. L'attribution des spectres de la forme non modifié de l'ARNtPhe de xénope a été réalisée. Un protocole de préparation d'extrait d'ovocyte a été établi, ce qui a permis de déterminer toutes les signatures RMN des modifications observables dans cet ARNt, notamment les signatures des modifications m1A14 et m1A58. Grâce aux études en extrait, il a été également possible de déterminer l'ordre d'incorporation des différentes modifications. De plus, des expériences préliminaires en ovocytes vivants ont été réalisées, jetant ainsi les bases pour de futures études sur le suivi de l'incorporation des modifications post-transcriptionnelles par RMN en cellules.