Experimental methodologies to explore 3D development of biofilms in porous media

Méthodologies expérimentales pour l'étude du développement 3D de biofilms en milieux poreux Les biofilms sont des communautés microbiennes se développant sur des interfaces, en particulier solide-liquide, où les micro-organismes sont enrobés dans une matrice polymérique auto-sécrétée. Le mode de vie sous forme de biofilm est prédominant dans les milieux naturels (par e.g. la texture glissante des fonds de rivières, les dépôts visqueux des canalisations et la plaque dentaire) et confère aux micro-organismes un environnement propice à leur développement. Ceci est particulièrement vrai dans des milieux poreux qui, de part leur important ratio surface/volume, constituent des substrats favorables à la colonisation. Le cadre des biofilms en milieux poreux forme une complexité multi-physique d’ordre élevée dans laquelle interagissent des mécanismes physiques, chimiques et biologiques multi-échelles encore mal compris et très partiellement maîtrisés. La rétroaction entre l’écoulement, la distribution spatiale des microorganismes et le transport de nutriments (par diffusion et advection) en est un exemple. Le développement de biofilms en milieux poreux est au centre de multiples procédés d’ingénierie, tel que les bio-filtres, la bio-remédiation des sols, le stockage de CO2, et de problèmes médicaux comme les infections. Un verrou significatif à l’avancée des connaissances est la limitation des techniques exploratoires en métrologie et imagerie dans des milieux opaques. L’objectif principal de cette thèse est la proposition de méthodologies expérimentales reproductibles et robustes permettant l’étude de biofilms en milieux poreux. Un dispositif expérimental en conditions physiques et biologiques contrôlées est proposé. De plus, un protocole d’imagerie 3D basé sur la micro-tomographie à rayons X (MT RX) associé à l’utilisation d’un nouvel agent de contraste (sulfate de baryum et gel d’agarose), est validé afin de quantifier la distribution spatiale du biofilm. Dans un premier temps, la méthodologie MT RX est comparée à une des méthodes les plus utilisées pour la visualisation de biofilms : la microscopie photonique par fluorescence, ici biphotonique (MBP). Cette comparaison est réalisée pour des biofilms de Pseudomonas Aeruginosa développés dans des capillaires transparents en verre, ce qui facilite l’application des deux modalités. Dans un second temps, une étude des incertitudes liées à l’imagerie est réalisée à travers l’évaluation de différentes métriques (volume, surfaces 3D, épaisseurs) pour un fantôme d’imagerie et trois algorithmes de segmentation différents. Les analyses quantitatives montrent que le protocole de MT RX permet une visualisation du biofilm avec une incertitude d’environ 17%, ce qui est comparable à la MBP (14%). La reproductibilité et la robustesse de la méthodologie MT RX est démontrée. La troisième étape du travail de recherche permet d’aboutir au développement d’un bioréacteur innovant élaboré par fabrication additive et contrôlé par un système micro-fluidique de haute précision. Le dispositif expérimental que nous avons conçu permet de suivre en temps réel l’évolution des propriétés de transport (perméabilité effective), les concentrations en O2 et le détachement de biofilm par spectrophotométrie ; ceci pour des conditions hydrodynamiques contrôlées. Notre méthodologie permet d’étudier l’influence de paramètres biophysiques sur la colonisation du milieu poreux, par exemple l’influence du débit ou de la concentration de nutriments sur le développement temporel du biofilm. En conclusion, ce travail de thèse propose une méthodologie expérimentale reproductible et robuste pour la croissance contrôlée et l’imagerie 3D de biofilms en milieux poreux en apportant la versatilité du contrôle de la micro-architecture du milieu, de l’écoulement et des conditions biochimiques de culture. A notre connaissance, l’approche scientifique suivie et les dispositifs expérimentaux associés constitue la méthodologie la plus complète à ce jour, pour l’étude de biofilms en milieu poreux.