Interplay between ABC membrane transporter BmrA and its membrane environment

Couplages entre un transporteur membranaire de type ABC, BmrA et son environnement membranaire Les ABC (ATP binding cassettes) transporteurs constituent une grande famille de protéine transmembranaire présentent dans tous les organismes. Les ABC hydrolysent l'ATP pour transporter une quantité immense de substrats amphiphiles, comme les lipides, steroids, peptides... Certains ABCs confèrent un phénotype cellulaire de multiresistance aux drogues des bactéries contre les antibiotiques à l’homme contre les agents anticancéreux, antiviraux ...Une question fondamentale pour comprendre le transport de drogues est comment les propriétés de membranes modulent la fonction et l’organisation spatio temporelle des ABCs transporteurs. Nous avons étudié en détails ces couplage avec BmrA, un ABC bactérien de B. subtillis en utilisant différents systèmes membranaires in vitro et différentes approches de biochimie et de biophysique membranaire. Dans un premier temps, après expression et purification des protéines en détergent, nous avons caractérisé l’hydrolyse d’ATP en fonction de l’état de l’environnement membranaire, solubilisé en micelle de détergent et en micelles mixtes. Les proteoliposomes ont été caractérisés en fonction de l’orientation des protéines, leur taux d’incorporation, leur taille et la lamellarité. Cela nous a permis de moduler de façon contrôlée la composition lipidique, la densité et la conformation des protéines et la courbure membranaire pour déterminer de façon quantitative les contributions respectives de ces paramètres de membranes. Ainsi, nous montrons que l’hydrolyse d’ATP est sensible à la spécificité lipidique quand la protéine est dans une bicouche et que les lipides négatifs et les lipides de type phosphatidylethanolamine stimulent de façon synergique l’activité hydrolytique. L’hydrolyse d’ATP diminue pour les fortes courbure positives. Dans un second temps, nous avons déterminé les conditions de reconstitution de BmrA dans des vésicules géantes qui ont ensuite permis d’étudier les rôles respectifs de la courbure et de la tensions membranaire dans l’organisation spatiale de BmrA par des approches de nanotube pulling. Les expériences en collaboration montrent que BmrA a une préférence marquée pour les régions membranaires à forte courbure conduisant à la formation de cluster de protéines et que cette préférence varie en fonction de l’état catalytique de la protéine. Finalement, nous avons mis au point une méthode pour étudier la dynamique des NBDs par transfert d'énergie de résonance de Förster au niveau de la molécule unique dans un système reconstitué par spectroscopie de fluorescence et de corrélation croisée.L’ensemble des données suggère que organisations spatiales des ABC transporteurs dans les cellules bactériennes et eucaryotes sont différentes avec la possibilité de tris dans des zones de fortes courbures lors de remodelages membranaires mais sans modification importante de la fonction.