Caractérisation des NO synthases de Klebsormidium nitens

Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule de signalisation cellulaire ubiquitaire. Chez les animaux, la synthèse du NO est principalement catalysée par une famille d’enzyme : les NO synthase (NOS). Chez les plantes, des activités de type NOS sensibles aux inhibiteurs de NOS de mammifères ont été mesurées, bien qu'aucune séquence codant pour des NOS similaires n'y ait été trouvée. De manière intéressante, des séquences NOS-like ont été identifiées chez une vingtaine d’espèces d'algues, et présentent une intéressante diversité structurale en comparaison aux NOS de mammifères. L'algue verte charophyte filamenteuse Klebsormidium nitens, un modèle biologique pour étudier l’adaptation au mode de vie terrestre, a été identifiée au laboratoire comme possédant deux NOS : i) la KnNOS1, qui présente une architecture canonique domaine oxygénase/domaine réductase ii) la KnNOS2, qui possède une structure atypique avec l’adjonction d’un domaine globine dans la partie C-terminale de la protéine.La présence de NOS d’une grande diversité moléculaire au sein de plusieurs espèces d’algue alors qu’elles sont absentes des plantes terrestres questionne sur l’évolution de cette famille d’enzyme chez les organismes photosynthétiques.La caractérisation fonctionnelle des KnNOS a été initiée par l’analyse de leurs séquences primaires nucléotidique et protéique. Depuis les séquences primaires protéiques, des modèles de prédiction de la structure 3D des KnNOS ont été réalisés via AlphaFold et la comparaison avec les modèles existants des NOS de mammifères a suggéré que les deux KnNOS soient fonctionnelles. L’étude de la position phylogénétique des KnNOS en comparaison aux autres NOS décrites chez les eucaryotes indique que les deux NOS de K. nitens pourraient résulter d’un événement de duplication récent. L’étude de l’abondance de leurs ARNm en réponse à différents stress abiotiques a mis en évidence des différences suggérant une sous-fonctionnalisation de ces deux protéines. Afin d’étudier les interactions des KnNOS une stratégie par pull-down a été retenue, nécessitant la production de la protéine recombinante KnNOS1 et KnNOS2. Bien que la production hétérologue des KnNOS n’ait pas encore abouti, des résultats prometteurs ont été obtenus en système hétérologue en levure. En parallèle, nous avons également construit le réseau in silico d'interactions protéine-protéine des NOS humaines en utilisant la base de données BioGRID et les données d'interactions des NOS humaines. Il est intéressant de noter que des gènes codant pour des orthologues de plusieurs de ces candidats ont été trouvés dans le génome de K. nitens. Certains de ces partenaires conservés sont connus pour être impliqués dans la régulation des NOS des mammifères et représentent des candidats intéressants pour une étude plus approfondie.Ce travail de thèse a apporté de nouvelles informations sur la famille des enzymes NOS notamment en caractérisant les deux isoformes de NOS de K. nitens et en mettant en avant des différences dans leur fonctionnement. Les outils moléculaires développés dans ce travail ouvrent la voie vers une caractérisation plus approfondie de ces protéines et va faciliter de futures recherches sur la signalisation NO dans la lignée verte.