Microscopie tridimensionnelle fonctionnelle asservie et stabilisée par scanner acousto-optique à haute cadence

Aujourd’hui mature, la microscopie à deux photons permet de visualiser l’activité fonctionnelle d’un grand volume du cortex cérébral et cérébelleux. La microscopie à deux photons progresse de manière asymptotique et continue en direction des limites théoriques définies par Theer et Denk (Theer et Denk, 2006). Cette percée des méthodes de microscopie par fluorescence dans les études en profondeur des circuits neuronaux est indissociable de l’évolution des indicateurs rapporteurs de l’activité neuronale et génétiquement encodés. La maîtrise des méthodes d’optimisation du comportement des indicateurs génétiques (vitesse, stabilité, brillance, longueur d’onde) permet d’enrichir la palette d’outils à disposition du biologiste. Le ciblage génétique des indicateurs fluorescents ouvre la voie d’un décryptage massif d’un grand nombre de mécanismes aujourd’hui méconnus. L’étude des circuits nécessite d’avoir à la fois des indicateurs fidèles du potentiel transmembranaire des neurones et des capacités d’imagerie in vivo de manière chronique, en profondeur et respectueuse des limites des échantillons. Ces besoins ont donné naissance à une modalité spécifique d’enregistrement optique. Cette modalité d’enregistrement combine un accès non séquentiel aux structures d’intérêt (RAMP) et une optimisation de l’intégration spatiale par motif holographique conçut pour l’excitation deux photons (ULoVE). L’accès non séquentiel permet d’augmenter la proportion d’information fonctionnelle et donc la pertinence des mesures au travers d’un meilleur rapport signal/bruit. En contrepartie, le taux d’informations morphologiques est réduit, ce qui rend cette modalité d’enregistrement très sensible au mouvement de l’échantillon. Une première approche est d’augmenter le volume d’intégration spatiale autour des structures d’intérêt pour diminuer l’impact du mouvement sur le signal fonctionnel. Cette approche introduit deux limitations : la densité du marquage doit être plus faible pour éviter une contamination du signal par des cellules adjacentes, le temps d’intégration par cellule est augmenté et cela a pour conséquence de limiter le nombre de cellules accessibles avec une bonne résolution temporelle. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé un dispositif de correction temps-réel du mouvement destiné à lever ces limitations. L’implémentation d’un dispositif de correction de mouvement sur un microscope existant se heurte à un certain nombre de difficultés liées à la conception d’origine. Ces difficultés sont renforcées par la nécessité de la reproductibilité d’un tel dispositif. L’ajout d’un système de correction de mouvement à l’AODscope a requis une refonte de l’électronique de pilotage du microscope. La synthèse des contraintes provenant des spécificités des signaux issus de l’imagerie à deux photons des tissus biologiques, de la dynamique des signaux fluorescents provenant des indicateurs génétiquement encodés et des particularités méthodes d’imageries a conduit à la constitution d’un ensemble d’exigences. À la lumière des recherches menées dans des domaines variés tels le suivi de particule, les systèmes asservis ou les méthodes de capture des proies par les prédateurs, ces exigences ont conduit à la conception d’une méthode de suivi du mouvement à la fois frugale en calcul, résistante au bruit et compatible avec les modalités d’imagerie classique et l’enregistrement RAMP. Les performances de cette nouvelle méthode de suivi de mouvement, intégrée dans une boucle de rétroaction sont étudiées en simulation, sur banc et in vivo, puis analysés en comparaison des méthodes existantes.