Optimization of vitreous cryo-sectioning for cryo electron tomography imaging of eukaryotic chromosomes in situ

Optimisation de la cryo-microtomie de sections vitreuses pour la microscopie électronique à transmission de chromosomes eucaryotes in situ Dans mon projet de doctorat, je me suis concentrée sur l'optimisation de l'obtention et de la collection de cryosections vitrifiées pour la cryo-tomographie électronique (cryo-ET) afin d'étudier la structure de la chromatine directement dans son environnement cellulaire natif. Mon objectif était de surmonter les principaux défis techniques qui ont longtemps limité l'utilisation des cryosections pour la cryo-ET — en particulier la mauvaise adhésion des sections, leur instabilité pendant l'imagerie et le faible rendement. Pour résoudre ces problèmes, j'ai développé une série de solutions méthodologiques, notamment une procédure de chargement électrostatique en deux étapes visant à améliorer l'attachement des sections aux grilles EM, ainsi que l'identification de films de support optimaux alliant stabilité mécanique et haute qualité d'imagerie. Ces avancées ont permis de collecter de manière reproductible un grand nombre de tomogrammes de haute qualité à partir d'échantillons tissulaires.Comme systèmes expérimentaux, nous avons choisi les embryons et les glandes salivaires larvaires de Drosophila melanogaster, pour lesquels j'ai développé des protocoles de préparation utilisant la congélation sous haute pression. En combinant la vitrification optimale et la procédure améliorée d'obtention et de collection de cryosections, j'ai obtenu des jeux de données cryo-ET in situ permettant l'identification directe des nucléosomes et de l'ADN linker au sein de la chromatine native. Cela m'a permis de quantifier la géométrie du linker, d'observer la variabilité conformationnelle des nucléosomes et d'identifier des particules nucléosomiques non canoniques in situ.Dans l'ensemble, ce travail démontre que, lorsqu'elles sont optimisées, les cryosections peuvent être une alternative robuste aux lamelles obtenues par cryo-FIB pour les études structurales de tissus et d'organismes multicellulaires. Les premiers résultats obtenus sur les chromosomes polytènes des glandes salivaires de Drosophila offrent une base prometteuse pour de futures recherches sur l'organisation de la chromatine et sa relation avec la régulation génétique au niveau moléculaire.