Действие двухвалентных катионов металлов на функционирование НАДФ+-зависимой малатдегидрогеназы из листьев кукурузы

Малатдегидрогеназа (МДГ, НАДФ-зависимая оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.82) – НАДФ+-МДГ (КФ 1.1.1.82) является важным ферментом, метаболизирующим органические кислоты растений. Целью данной работы являлось определение таких регуляторных свойств энзима как влияение двухвалентных металлов на его активность. В качестве объекта исследования использовали листья 10-дневных проростков кукурузы. Разделение тканей проводили по методу Клечковского. Очистка фермента была проведена классическим методом. В качестве исследуемых ионов брались хлориды таких двухвалентных катионов металлов как магний, кальций, барий и марганец. Таким образом, четырех стадийная очистка, включающая в себя гомогенизацию, фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе G-25 и ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Sephacel, позволила получить высокоочищенные препараты НАДФ+-малатдегидрогеназы из мезофилла листьев кукурузы. При этом степень очистки выросла в 57 раз, а процент выхода исследуемого белка от общего равнялся 6%. Удельная активность очищенной НАДФ+-зависимой малатдегидрогеназы при пересчете на миллиграмм белка составила 91 ферментативную единицу. При универсальном окрашивании нитратом серебра и специфическом окрашивании тетразолиевым методом полиакриламидного геля, полученного после электрофореза очищенной МДГ, была обнаружена только одна белковая полоса, что свидетельствует о гомогенности очищенного препарата малатдегидрогеназы. Исследование влияния катионов различных металлов позволило выявить их действие на функционирование малатдегидрогеназы. Было изучено влияние хлоридов ионов Mg2+, Мn2+, Ва2+, Са2+ на активность очищенного препарата. Показано, что магний в небольших концентрациях (до 3 мМ) активирует НАДФ+-зависимый МДГ. Марганец и барий, напротив, ингибируют фермент. Ионы кальция не оказывали влияния на активность МДГ. Анализ полученных данных, осуществленный с помощью графиков Лайнуивера-Берка, позволил установить наличие разных типов ингибирования. Конкурентный тип ингибирования характерен для действия катионов марганца. Для катионов бария выявлен бесконкурентный тип торможения работы фермента.