Ανασυνδυασμένη πρωτεϊνική κινάση Musk και χρήση της για την ανάπτυξη αντιγονοειδικής θεραπείας της Musk - εξαρτώμενης βαριάς μυασθένειας

Η μυασθένεια gravis (Myasthenia gravis, MG) είναι μία αυτοάνοση νόσος η οποία επηρεάζει την ομαλή λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (80-85%) εμφανίζουν αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AChR), ενώ 5-7% των ασθενών εμφανίζουν αντισώματα έναντι της ειδικής κινάσης μυϊκής (MuSK). Η MuSK είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη της νευρομυϊκής σύναψης αλλά επίσης, εκφράζεται και στην ώριμη νευρομυϊκή σύναψη όπου εμπλέκεται, μέσω της αγρίνης, στην αγκυροβόληση των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στη μεμβράνη. Η MuSK αποτελείται από μια εξωκυτταρική περιοχή (ECD), η οποία περιέχει τρεις περιοχές τύπου–ανοσοσφαιρίνης (Ig-like) και μια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (Fz), μια διαμεμβρανική και μία κυτταροπλασματική περιοχή η οποία περιέχει την καταλυτική περιοχή της κινάσης.Οι θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Ωστόσο, η ανοσοκαταστολή συχνά συνδέεται με σοβαρές παρενέργειες ενώ κατά τη χορήγηση ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών, η πιθανότητα μετάγγισης άγνωστων μέχρι στιγμής μολυσματικών παραγόντων δεν μπορεί να αποκλειστεί. Επιπλέον, σε καμία από τις παραπάνω θεραπευτικές προσεγγίσεις δεν στοχεύονται επιλεκτικά τα αντισώματα και ταυτόχρονα συνοδεύονται από υψηλό κόστος εφαρμογής και περιορισμένη διαθεσιμότητα. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την MuSK μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της ανοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK ως ανοσοπροσροφητή σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες οι οποίες θα αφαιρούν από τον ορό του ασθενούς μόνο τα MuSK αντισώματα.Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK σε διάφορα συστήματα έκφρασης στοχεύοντας στη δημιουργία ενός ανοσοπροσροφητή ο οποίος παράγεται σε μεγάλες ποσότητες αλλά και σε μία διαμόρφωση η οποία είναι ικανή να αναγνωρίζεται από την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων. Με σκοπό τη δημιουργία κατάλληλων ανοσοπροσροφητών εκφράστηκαν δύο διαφορετικές πρωτεΐνες, όπου η μία αποτελείται από ολόκληρο το εξωκυτταρικό τμήμα της MuSK (MuSK-ECDf) ενώ η άλλη είναι μικρότερη αφού υπολείπεται την περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (MuSK-ECDΔFz). Οι προσπάθειες στα συστήματα έκφρασης COS-7, HEK293 και E.coli απέβησαν άκαρπες αφού είτε οι πρωτεΐνες δεν εκφράστηκαν στη σωστή διαμόρφωση ή δεν αποδείχθηκαν κατάλληλοι ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο πρωτεΐνες εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή και σε ικανοποιητικά επίπεδα έκφρασης με την MuSK-ECDf πρωτεΐνη να εμφανίζει καλύτερα επίπεδα έκφρασης. Μετά τον καθαρισμό των δύο πρωτεϊνών με χρωματογραφίες συγγένειας και μοριακής διήθησης, οι πρωτεΐνες ακινητοποιήθηκαν σε υπόστρωμα σεφαρόζης και ακολούθησε ο χαρακτηρισμός τους ως ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο ανοσοπροσροφητές έχουν τη δυνατότητα να αφαιρούν την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων από τον ορό των MuSK-μυασθενών με τον MuSK-ECDΔFz ανοσοπροσροφητή να εμφανίζει μικρότερη ικανότητα πρόσδεσης αντισωμάτων σε ορισμένους ορούς. Ο χαρακτηρισμός των δύο ανοσοπροσροφητών έδειξε ότι και οι δύο είναι ειδικοί για τα MuSK αντισώματα, μπορούν να αφαιρούν μεγάλες ποσότητες MuSK αντισωμάτων από τον ορό MuSK-μυασθενών, μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, να αποθηκευτούν για μεγάλο χρονικό διάστημα και επίσης, παραμένουν σταθεροί στο υπόστρωμα σεφαρόζης κατά τη διάρκεια της ανοσοπροσρόφησης. Όι παραπάνω παράμετροι μπορούν να οδηγήσουν σε μία θεραπευτική προσέγγιση με χαμηλό κόστος για τον ασθενή αλλά ιδιαίτερα αποτελεσματική ως προς την αφαίρεση μόνο των παθογόνων MuSK αντισωμάτων.Στη συνέχεια, ακολούθησαν πειράματα χρησιμοποιώντας ζώα εργαστηρίου στα οποία φάνηκε ότι τα πειράματα ανοσοπροσρόφησης με τον MuSK-ECDf ανοσοπροσροφητή δεν εμφανίζουν καμία τοξική επίδραση σε κουνέλια. Επίσης, με πειράματα παθητικής μεταφοράς σε ποντίκια αποδείχθηκε η αποτελεσματικότητα των ανοσοπροσροφητικών στηλών να αφαιρούν τα MuSK αντισώματα από τον ορό των MuSK-μυασθενών όπως επίσης και η παθογονικότητα των απομονωμένων MuSK αντισωμάτων.Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα καθιστούν εφικτή την ανάπτυξη μίας νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη MuSK μυασθένεια με χαμηλό κόστος για τον ασθενή και με το πλεονέκτημα της επιλεκτικής αφαίρεσης των MuSK αντισωμάτων από τον ορό.