Transcriptional regulation by v-ErbA, the oncogenic counterpart of thyroid hormone receptor (TR)

Η θυρεοειδής ορμόνη (Τ3) παίζει πολλαπλό και σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση, στην ανάπτυξη, στην μεταμόρφωση των αμφίβιων, στη διαφοροποίηση και στη νεοπλασία. Η δράση της Τ3 διενεργείται μέσω της σύνδεσής της με τον υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης (TR), ο οποίος με τη σειρά του συνδέεται σε ειδικές αλληλουχίες DNA που ονομάζονται στοιχεία απόκρισης στη θυρεοειδή ορμόνη (TREs). Ο TR παρουσία Τ3 ενεργοποιεί τη μεταγραφή ενώ χωρίς ορμόνη ο TR την καταστέλλει χρησιμοποιώντας πληθώρα μηχανισμών. Η v-ErbΑ ογκοπρωτεϊνη είναι μια ιική μεταλλαγμένη παραλλαγή του TRα που κωδικοποιείται από τον ιό της ερυθροβλάστωσης των πτηνών (AEV). Η συνεργασία του v-erbA με το v-erbB, το δεύτερο ογκογονίδιο του AEV με δραστικότητα κινάσης τυροσίνης, οδηγεί σε ερυθρολευχαιμία ως αποτέλεσμα του ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού και της παύσης της διαφοροποίησης. Λόγω μεταλλάξεων, το ν-erbΑ δεν μπορεί να δεσμεύσει Τ3 και έτσι δεν μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή, όπως το κυτταρικό ομόλογό του, ο TR. Η υπόθεση ότι το v-ErbA συμπεριφέρεται ως TR χωρίς προσδεμένη ορμόνη είναι ελκυστική, αλλά αντιβαίνει σε μια σειρά από πειραματικές παρατηρήσεις. Ο στόχος των μελετών της παρούσας διατριβής είναι να διαλευκάνουν τους μοριακούς μηχανισμούς που υπαγορεύουν την ογκογόνο δράση του v-erbA.Χρησιμοποιώντας χαρτογράφηση υπερευαισθησίας σε DNAάση Ι εντοπίσαμε δύο υποψήφιες περιοχές (HS1 και HS2) ρύθμισης της μεταγραφής του ερυθροειδικού γονιδίου της καρβονικής ανυδράσης ΙΙ (CA II) από το v-erbA. Η HS1 βρίσκεται 7 kb ανοδικά (3’) ενώ HS2 βρίσκεται 8 kb καθοδικά (5’) της θέσης έναρξης μεταγραφής, εντός του δεύτερου ιντρονίου. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης συμπλόκων v-ErbA/DNA καθώς και in vitro και in vivo footprinting πειράματα απέδειξαν ότι η ιντρονική περιοχή HS2 έχει μία θέση δέσμευσης για v-ErbΑ (VRE). Σημαντικό είναι ότι η in vivo κατάληψη του VRE από το v-ErbΑ συμπίπτει με καταστολή της μεταγραφής της CA ΙΙ, ενώ όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται για διαφοροποίηση και εκφράζεται η CA II, τότε το v-ErbA δεν προσδένεται στο VRE. Χρησιμοποιώντας ανάλυση μεταλλαξιγένεσης και πειράματα επιμόλυνσης κυττάρων αποδείξαμε ότι η περιοχή HS2 ενεργοποιεί τη μεταγραφή ανεξάρτητα από τη θέση και τον προσανατολισμό της σε σχέση με υποκινητές, και ότι η δραστικότητα ως ενισχυτή της HS2 εξαρτάται από ερυθροειδικούς παράγοντες που προσδένονται στις GATA αλληλουχίες που βρίσκονται γειτονικά στο VRE. Έτσι, το ν-ErbΑ φαίνεται να εξουδετερώνει την θετική μεταγραφική δραστικότητα των ερυθροειδικών GATA-παραγόντων και η HS2 συμπεριφέρεται ως ισχυρός ερυθροειδικός ενισχυτής που καταστέλλεται από το v-ErbΑ. Δείξαμε επίσης ότι η αρχιτεκτονική της χρωματίνης της HS2 ρυθμίζεται από το δεσμευμένο με ορμόνη TR σε ερυθροειδή πρωταρχικά κύτταρα και ότι το v-ErbΑ εμποδίζει την πρόσδεση του δεσμευμένου με ορμόνη TR στο VRE, με αποτέλεσμα την άρση της μεταγραφικής ενεργοποίησης που προκαλεί η Τ3. Αυτή η δράση του v-ErbA μπορεί να συσχετίζεται με την παρατηρούμενη ογκογονικότητά του. Με πειράματα ανοσοκαθίζησης δείξαμε επίσης ότι το v-ErbΑ μπορεί να αλληλεπιδράσει με τον ενδογενή συν-καταστολέα της μεταγραφής, τον NCoR. Ωστόσο, ο NCoR δεν φαίνεται να είναι ζωτικής σημασίας για την καταστολή μέσω ν-ErbΑ, ενώ άλλοι συν-καταστολείς μπορεί να είναι πιο δραστικοί σε σύμπλοκα με το ν-ErbA.Συμπερασματικά, οι μελέτες μας δίνουν νέα δεδομένα για τον μηχανισμό με τον οποίο το ν-erbΑ καταστέλλει τη μεταγραφή, δηλαδή μέσω της ρύθμισης του ιντρονικού ενισχυτή HS2 του ερυθροειδικού γονιδίου της CA II και διαμορφώνοντας την αρχιτεκτονική της χρωματίνης στην περιοχή της CA II μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες, και παρουσιάζουν πιθανούς μηχανισμούς που εξηγούν το ρόλο του v-erbΑ στο λευχαιμικό μετασχηματισμό.