Breaking down the neglected : ubiquitination role in macrophage infection by Leishmania infantum

Eliminer les maladies parasitaires négligées : rôle de l’ubiquitination dans l’infection des macrophages par Leishmania infantum La leishmaniose viscérale est une maladie tropicale négligée causée par Leishmania donovani et L. infantum qui représente un grave problème de santé publique. Le besoin de développer de nouveaux agents thérapeutiques contre cette maladie est urgent et nécessite d’approfondir nos connaissances de la biologie de ces parasites. L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui régule divers processus biologiques chez les Eucaryotes et qui a été peu étudiée dans la leishmaniose. Afin d'aborder le rôle de l'ubiquitination dans l'infection de la cellule hôte, nous avons 1) établi le pattern d'ubiquitination des protéines des macrophages murins dérivés de moelle osseuse (BMM) dans les premières heures de l’infection par L. infantum par une analyse protéomique (ubiquitinome) et 2) entrepris une analyse fonctionnelle de la déubiquitinase Otubaine de L. infantum (OtuLi) par la génération et la caractérisation d’une lignée « knock-out ». Notre analyse de l'ubiquitinome a identifié 3749 peptides diGly correspondant à 595 protéines dans les BMM infectés et 4603 peptides diGly correspondant à 720 protéines dans les BMM contrôles. L'exploration des données a permis de définir un pattern d’ubiquitination spécifique à l'infection parasitaire comprenant 104 protéines uniquement ubiquitinées lors de l’infection par opposition à 229 protéines uniquement ubiquitinées dans le contrôle. Ces protéines ubiquitinées spécifiques à l’infection sont impliquées dans des processus liés à l'immunité innée, la traduction (ribosome) et la protéolyse médiée par l'ubiquitine. Par ailleurs, une analyse quantitative “label-free” du protéome global a montré que 54 protéines étaient différentiellement abondantes dans les BMM infectés par L. infantum par rapport au contrôle, dans lesquelles 25 étaient régulées positivement, 29 régulées négativement et, sur la totalité des protéines modulées, 21 étaient ubiquitinées. L’analyse détaillée du protéome global a révélé 764 protéines exclusivement détectées dans les macrophages infectés, comprenant 28 protéines ubiquitinées. Ces analyses nous ont permis d’identifier de nouvelles protéines ubiquitinées et de nouveaux sites d’ubiquitination. Concernant la désubiquitination, nous avons conçu un système CRISPR/Cas9 avec une endonucléase fonctionnelle intégrée au locus de l'ARNr 18S de L. infantum, une stratégie sans clonage basée sur l'amplification par PCR du HRC avec un bras d'homologie de 30 pb et une transcription rapide in vitro de l'ARNsg. La génération d'un « knock-out » Otuli-/- utilisant cette stratégie a servi de preuve de concept et a démontré que le « knock-out » d'OtuLi retardait la croissance des promastigotes pour atteindre la phase stationnaire et affectait le taux d'infection précoce des macrophages. Nos données ouvrent ainsi la voie à une meilleure la compréhension du rôle des processus d'ubiquitination dans la leishmaniose viscérale.