Caractérisation de la contribution du proofreading et du mismatch repair à la réparation des mutations spontanées chez Bacillus subtilis

Les mutations spontanées sont au cœur des processus d'évolution. Elles se produisent principalement lors de la réplication de l'ADN par les ADN polymérases, qui sont susceptibles de commettre des erreurs. Ces mutations sont contrebalancées par deux systèmes de réparation : (1) une exonucléase associée à la polymérase - son activité est connue sous le nom de proofreading ; (2) le système de réparation des mésappariements (MMR). Discerner la contribution de ces deux systèmes au taux de mutation est crucial pour comprendre les processus évolutifs.Nous avons construit plusieurs souches de Bacillus subtilis avec un allèle déficient en exonucléase de l'ADN polymérase polC et/ou un allèle déficient d'un gène du MMR placé sous le contrôle d'un promoteur dépendant de l'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Pour valider les phénotypes hypermutateurs inductibles et caractériser les réponses à la concentration d'IPTG, les taux de mutation ont d'abord été évalués par des tests de fluctuation.Nous avons ensuite appliqué une stratégie d'accumulation de mutations (MA) suivie d'un séquençage du génome complet pour évaluer les taux de mutation à l'échelle du génome. Le principe des MA est d'imposer de manière répétée des goulots d'étranglement aléatoires à une population afin de maximiser la dérive génétique et donc de minimiser la sélection : les mutations sont donc accumulées de manière neutre. Des séquençages intermédiaires permettant de reconstruire l'histoire des mutations ont révélé que le taux de mutation de la souche ayant le taux de mutation le plus élevé avait diminué. Ces résultats remettent en question l'hypothèse de l'absence de sélection dans les expériences de MA avec des taux de mutation élevés.Nous avons obtenu pour chaque souche le taux et les spectres de mutation à l'échelle du génome, une de nos souches hypermutatrices atteignant un taux de mutation global ~ 1000 fois plus élevé que celui de B. subtilis sauvage. Parmi huit facteurs considérés comme potentiellement influents sur les spectres de mutation, la paire de référence, son orientation par rapport à la réplication et les nucléotides adjacents ont un effet significatif. La fréquence des types de mutations en fonction de l'activité de chaque système a révélé que le spectre de mutation est le moins uniforme lorsque l'exonucléase PolC est active et que le MMR ne l'est pas, ce qui suggère que la première génère des biais de mutation qui sont ensuite contrebalancés par le second.En parallèle, nous avons cherché à produire des outils pour l'évolution dirigée avec B. subtilis. L'augmentation inductible du taux de mutation est souhaitable pour l'évolution dirigée in vivo : elle permet d'accélérer l'évolution et de contrôler le rythme et l'ampleur de la production de diversité génétique. Un modèle (C++) permettant des simulations individu-centrées de l'évolution de souches hypermutatrices dans un chemostat, un système simple de culture continue, a montré que le contrôle du taux de mutation permettrait de gagner rapidement des mutations bénéfiques tout en acquérant pas ou peu de mutations délétères, ce qui n'est pas possible avec un taux de mutation continuellement élevé.Enfin, nous avons cherché à développer avec B. subtilis l'évolution continue assistée par les phages (PACE), un outil d'évolution dirigée qui n'a été mis en œuvre qu'avec E. coli. Nous nous sommes intéressé aux conditions de co-culture du phage lytique SPP1 et de B. subtilis en culture continue. Ces expériences ont révélé des comportements surprenants, tels que le maintien des phages sans chute de la densité optique (DO) indiquant la lyse, et l'émergence d'oscillations de la DO.Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent les taux de mutation spontanée, leur réparation et leur impact potentiel sur l'évolution. Ils pavent également la voie pour un développement des technologies d'évolution expérimentale et dirigée utilisant la culture continue et/ou les phages.