Abstrak  Peningkatan sampah organik diindonesia, semakin meningkat akibat pertumbuhan jumlah penduduk. Dalam upaya menangani masalah tersebut, pemanfaatan limbah organik menjadi eco-enzyme menjadi solusi yang mudah terutama dalam penggolahanya. Eco-enzyme hasil dari fermentasi limbah sampah organik seperti kulit buah dan sayuran, gula pohot dan air. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jenis bahan organik pembuatan eco-enzyme terhadap daya hambat bakteri staphylococcus aureus. Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode difusi dengan fermentasi eco-enzyme menggunakan campuran limbah organik. Campuran bahan organik yang digunakan dibagi menjadi 3 eco-enzyme 1= kulit lemon;gula; air, eco-enzyme 2= kulit lemon;kulit nanas; gula; air dan eco-enzyme 3= kulit lemon; kulit nanas; sayur kangkung; gula; air. serta uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi. Metode analisis data yang digunakan yaitu metode One Way Analysis of Varience (ANOVA satu arah). Berdasarkan hasil penelitian uji aktivitas antibakteri eco-enzyme terhadap staphylococcus aureus menunjukkan bahwa kombinasi bahan organik tertentu memiliki efektivitas yang berbeda. Kombinasi bahan organik yang paling signifikan dalam menghambat bakteri staphylococcus aureus adalah eco-enzyme dua dan eco-enzyme tiga, dengan rata- rata diameter zona hambat yang didapatkan 11,38 mm dan 11,39 mm. Hasil uji ANOVA diperoleh nilai signifikan 0,004<0,05, dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan diameter zona hambat dari campuran bahan organik pada eko-enzim. Dapat disimpulkan bahwa banyaknya campuran jenis bahan organik yang digunakan pada eco-enzyme, maka semakin kuat kemampuanya dalam menghambat bakteri staphylococcus aureus.