Implication de la co-hélicase DciA dans la réplication chez Vibrio cholerae

Lors de la réplication bactérienne, les hélicases réplicatives séparent les deux brins d'ADN devant la fourche de réplication. Chez les bactéries, la gestion de ces hélicases pendant l'initiation de la réplication a été extensivement étudiée chez Escherichia coli, une bactérie dans laquelle la charge et l'activation de l'hélicase, DnaB, sont strictement dépendantes de la co-hélicase DnaC in vitro et in vivo. Une analyse phylogénétique a permis d'établir que la présence de DnaC est restreinte à quelques espèces bactériennes seulement ; la plupart possédant à la place la co-hélicase bactérienne ancestrale, DciA. In vitro, DciA augmente l'efficacité de chargement de DnaB, mais contrairement aux systèmes DnaC, les hélicases utilisant DciA sont capables de se charger seules sur l'ADN. In vivo, des analyses cytométriques ont confirmé l'indépendance de DnaB, vis-à-vis de sa co-hélicase DciA, dans sa charge et son activation. DciA n'est donc pas nécessaire au chargement de DnaB, pourtant, comme DnaC, elle est essentielle. Dans ce contexte, notre objectif est d'investiguer le rôle de DciA dans l'initiation de la réplication.Une analyse du programme de réplication via la fréquence des marqueurs génétiques (MFA) dans une population déplétée en DciA révèle un déficit de la réplication du bras droit du chromosome 1 (Chr.1) comparé au bras gauche, similaire à la population sauvage. Ce profil s'explique par la présence de deux populations, l'une dont la réplication est bidirectionnelle et l'autre unidirectionnelle du côté gauche. Les profils MFA de souches mutantes de la réparation de cassure d'ADN, indiquent l'implication de la protéine RecB dans tous les évènements d'initiation en absence de DciA. Grace au développement d'une technique dédiée, nommée ANSseq, j'ai pu mettre en évidence l'appariement entre brins néosynthétisés spécifiquement à gauche de l'origine révélant la présence d'extrémités d'ADN double brin (reconnues par RecB), formées dans le cas d'une progression unidirectionnelle de la fourche. La dégradation du Chr.1 a été déduite de l'observation, par cytométrie en flux et par MFA, d'une sous-population composée uniquement du Chr.2, alors que sa réplication est dépendante de celle du Chr.1.Nous proposons un modèle expliquant l'ensemble de nos données. En absence de DciA, une seule hélicase réplicative est chargée et activée au niveau de l'origine de réplication, assurant la réplication du bras gauche du Chr.1. Les contraintes topologiques devant la fourche de réplication gauche, couplées à l'absence de fourche à droite, conduisent à l'appariement des brins néosynthétisés à partir des extrémités laissées libres au niveau de l'origine. Ces structures peuvent ensuite être prises en charge par des activités de redémarrage des fourches, telles que RecB, qui permettra de démarrer la réplication à droite, assurant ainsi une réplication bidirectionnelle à partir d'une initiation unidirectionnelle. Mais sans prise en charge par ces activités de réparation, la réplication initiée unidirectionnellement conduirait à la dégradation du Chr.1. La réplication unidirectionnelle est-elle la raison de l'essentialité de DciA ? Pour y répondre, une réplication unidirectionnelle a été induite indépendamment de DciA. Malgré un niveau de dégradation similaire du Chr.1, la souche reste viable. La démonstration que l'essentialité de DciA est indépendante de son rôle dans l'initiation du Chr.1 a pu être obtenue en montrant la létalité d'une souche dont l'initiation dépend uniquement de l'ori2, donc indépendante de DciA. Par l'ensemble de ce travail nous pouvons conclure que DciA assure ainsi la bidirectionnalité de l'initiation de la réplication et présente un autre rôle essentiel qui reste à découvrir.