Blocking proteasomal degradation by tampering with the ubiquitination machinery inhibits mouse norovirus propagation

L’inhibition de la dégradation protéasomale causée par l’altération du bon fonctionnement du processus d’ubiquitination influe négativement sur la propagation du norovirus murin Le norovirus, un virus non-enveloppé à ARN simple brin positif (+) de la famille des Caliciviridae est très contagieux et résistant. Un important effort de recherche est mené pour comprendre les mécanismes de la pathogenèse norovirale. Le système immunitaire inné est principalement activé lors des infections à norovirus. L'ubiquitination est un processus post-traductionnel ATP-dépendant, qui régule de nombreuses étapes de cette réponse immunitaire en catalysant l’ajout de différents types de chaînes de polyubiquitine sur certains résidus lysine de protéines cibles de manière à réguler leur sort.Il est à noter que des niveaux accrus de polyubiquitination peuvent être mesurés dans des cultures de macrophages après infection avec la souche de norovirus murin S99 (MNoV_S99). Dans une première étude, nous avons évalué comment l'altération de la formation des chaînes de polyubiquitine pouvait affecter le cycle de vie de MNoV_S99. En utilisant la lignée cellulaire de macrophage Raw264.7, plusieurs lignées cellulaires stables ont été générées en surexprimant les constructions YFP-Ubiquitin_WT, _K29R, _K48R ou_K63R. Toutes les constructions non-WT codent une protéine de fusion d'ubiquitine dont une lysine a été mutée en un résidu arginine, empêchant ainsi la formation des chaînes de polyubiquitine correspondantes. Une expression significativement réduite de plusieurs marqueurs viraux ainsi qu’une diminution significative des titres viraux a pu être mesurée seulement dans les cellules K48R. Cette régulation négative n’était pas liée à une entrée virale perturbée, mais plutôt par une hypersécrétion constitutive de la cytokine pro-inflammatoire TNF générant ainsi un environnement hostile à la propagation du MNoV_S99. L’ajout de chaînes de polyubiquitine K48 sur un substrat entraîne généralement celui-ci vers la dégradation protéasomale. Nos données sont les premières à suggérer que le MNoV_S99 bénéficie de la régulation à la baisse d’un ou plusieurs composants cytosoliques anti-viraux, encore non identifiés, vraisemblablement sensibles à la dégradation protéasomale. Les E3-ubiquitine ligases jouent un rôle central dans le processus d'ubiquitination en sélectionnant les substrats à ubiquitiner. Il a été démontré que SMURF1, une ubiquitine ligase à domaine HECT, atténue la demi-vie de plusieurs agents pathogènes par le biais de l'ubiquitination K48.Dans la seconde étude présentée dans ce manuscrit, nous avons analysé le rôle joué par SMURF1 dans la propagation du MNoV_S99. Tout d’abord, nous avons identifié l’interaction de SMURF1 avec la principale protéine de capside norovirale VP1. Mais cette interaction n'est pas associée à l'ubiquitination de la capside virale, ce qui suggère que le virus lui-même n'est pas ciblé par la dégradation protéasomale. En effet, lorsque des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM), de souris, où Smurf1 est inactivé par rapport à des souris sauvages, ont été infectés par le MNoV_S99, nous avons mesuré une diminution significative de l'expression de plusieurs marqueurs viraux. De même, les titres viraux dans les cultures Smurf1-/-étaient significativement inférieurs à ceux des BMDM WT. Ceci suggère un rôle bénéfique de SMURF1 et de l'ubiquitination K48-dépendante dans le cycle de vie des norovirus. Ceci a été confirmé par le fait que les BMDM WT traités avec l'inhibiteur de protéasome MG132 ont montré une production de MNoV_S99 significativement réduite.Dans l'ensemble, nos données permettent de mettre en lumière un rôle bénéfique de l'activité protéasomale dans le maintien d'un environnement permissif dans la propagation de la souche S99 du norovirus murin.