Chemical biology approaches to quantify protein S-acylation

Approches de chémobiologie pour quantifier la S-acylation des protéines La S-acylation est une modification post-traductionnelle des protéines qui correspond à la formation d’une liaison covalente entre un acide gras et un résidu cystéine. L'ajout de ce groupement hydrophobe peut modifier la localisation des protéines et affecter leur structure et/ou leur stabilité. La réversibilité et le dynamisme de cette modification enzymatique lui confèrent un rôle de régulateur dans les cellules, avec une implication observée dans de nombreux processus biologiques importants. Des aberrations dans les cycles de S-acylation ont été associées à différentes maladies humaines, telles que des cancers ou des maladies neurodégénératives. Les méthodes de protéomique existantes reposent principalement sur la quantification relative de la S-acylation des protéines. Notamment, il n’existe pas de méthodes permettant de quantifier précisément les variations des niveaux de S-acylation de chaque cystéine. Ce projet de thèse s'est concentré sur le développement d'une méthode de quantification de la S-acylation des cystéines dans un seul échantillon de protéome. Nous avons choisi de baser la méthode sur le marquage séquentiel et différentiel des cystéines libres et des cystéines S-acylées à l'aide d'une paire de sondes chimiques marquées isotopiquement. Les sondes ont des structures identiques, composées d'un électrophile pour alkyler les cystéines, d'une fonction alcyne, et d’isotopes légers et lourds permettant d’introduire une différence de masse (sonde « légère » (12C, 14N) et sonde « lourde » (13C, 15N)). Les cystéines marquées sont ensuite couplées par réaction click à un agent de capture portant un motif biotine et un azoture. Après digestion par la trypsine, les peptides contenant des cystéines sont enrichis à l'aide de billes de NeutrAvidin. Suite à leur élution des billes, les peptides marqués sont analysés par LC-MS/MS. L'analyse MS fournit un ratio de marquage lourd/léger pour les cystéines marquées dans un seul échantillon de protéome, révélant le pourcentage de S-acylation de ces cystéines. Les outils chimiques (sondes et agents de capture) ont été synthétisés et le pipeline a été développé, avec la sélection des différents paramètres des étapes de traitement des protéines à l'aide d'analyses qualitatives (Western blot). Des analyses par protéomique ont ensuite permis d'étudier plus en détail des variables, telles que les couples de sondes et d’agents de capture, les paramètres d'analyse LC-MS/MS et le traitement des données pour calculer les pourcentages de S-acylation. La méthode a été appliquée pour détecter les changements des niveaux de S-acylation suite à un stimulus externe, permettant l’acquisition de nouvelles informations sur certaines voies de signalisation et des processus biologiques associés. Les optimisations de la méthode seront poursuivies, notamment avec la comparaison de sondes possédant de nouvelles structures et une automatisation du pipeline. Nous prévoyons une large application de la méthode développée à l'étude des niveaux de S-acylation des cystéines des protéines et de leur lien avec différentes pathologies, ce qui pourrait révéler des traitements innovants.