Actin re-organization and lipid dynamics modulated by myosin 1b

Réorganisation de l'actine et dynamique des lipides modulé par la myosine 1b Les myosines I sont des protéines motrices de la superfamille des myosines, comprenant huit isoformes allant de la myo1a à la myo1h dans les cellules de mammifères. Ces moteurs se lient aux filaments d’actines via leurs domaine moteur et aux lipides chargés négativement, en particulier PI(4,5)P2, via leurs domaine de queue. Les myosines I jouent un rôle clé dans les processus de déformation des membranes basés sur l’actine, notamment les lamellipodes, les filopodes ou l’endocytose. Malgré leurs importances, l’effet précis de l’activité mécanique des myosines I restent aujourd’hui élusif.Les myosines I produisent leurs activités mécaniques quand liés à l’actine et la membrane. Dans cette thèse, nous avons fait l’hypothèse que les forces mécaniques générées par les myosines I à l’interface actine-membrane sont transmises à la fois à l’actine et à la membrane, ainsi affectant l’organisation de l’actine et les dynamiques de la membrane. Afin de tester cette hypothèse, nous avons utilisé des systèmes reconstitués in vitro composés de membrane lipidique artificielles et de protéines purifiées pour quantifier l’effet de la myo1b sur la réorganisation de l’actine et la mobilité des lipides.Dans l’espoir de mesurer la contribution des myo1b à la dynamique des lipides, nous avons développé une méthode simple et robuste pour produire des bicouches lipidiques asymétriques sur un support de verre (SLBs). Le lipide d’intérêt, dont la diffusion est mesurée, est ainsi uniquement présent dans le feuillet supérieur de la membrane en contact avec la solution aqueuse et non le substrat, connu pour affecter la diffusion. A l’aide de la redistribution de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), nous avons validé la fluidité de PI(4,5)P2 fluorescents, interagissant avec la myo1b, ainsi que de PI fluorescents, sans interaction avec la myo1b.Pour étudier l’effet de la myo1b sur la réorganisation de l’actine, nous avons utilisé un système minimal consistant de SLBs asymétriques pour PI(4,5)P2 densément couvertes de filaments d’actines formant une couche nématique attaché à la membrane via les myo1b. Nous avons observé que l’activité motrice des myo1b peut réorganiser les filaments d’actines, produisant des défauts topologiques et modifiants la morphologie de ceux-ci. A l’aide de microscopie à polarisation, nous avons trouvé que les filaments d’actines dans ces défauts étaient densément regroupés et alignés, indiquant un tri et un alignement opéré par les myo1b.Nous avons ensuite quantifié la dynamique des lipides dans ce système. A l’aide de FRAP, nous avons observé la capacité des myo1b à influencer la diffusion des lipides : PI(4,5)P2 diffuse plus rapidement dans les régions avec des défauts nématiques que dans les régions environnantes. Un effet similaire, bien que plus faible, est observé pour PI. En présence d’inactive myo1b, la diffusion de PI(4,5)P2 et PI est diminué, démontrant l’importance de l’activité motrice. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents, nous avons effectué des suivis de particules uniques de Atto647N-DOPE, un lipide sans interaction avec les myo1b. Nous avons observé différents types de diffusion dans les défauts topologiques crées par les myo1b.Finalement, les mesures quantitatives effectuées sur notre système biomimétique reconstitué démontrent que l’activité motrice des myo1b peut affecter l’architecture des réseaux d’actines ainsi que la dynamique des lipides. Sachant que les structures de toutes les myosines I sont particulièrement conservées et proches, nos résultats pourraient s’appliquer à l’ensemble des myosines I, apportant de nouvelles informations sur le potentiel rôles des myosines I à l’interface actine-membrane.