The regulatory landscape of Mycobacterium tuberculosis metabolism : Phosphorylation-driven control of large glutamate dehydrogenase (L-GDH)

Régulation du métabolisme Mycobacterium tuberculosis : modulation phosphorylation-dépendante de la glutamate déshydrogénase de grande taille (L-GDH) Afin de faire face aux fluctuations de la disponibilité en nutriments, les micro-organismes ont développé une multitude de systèmes de transduction du signal permettant de détecter l'état nutritionnel et d'induire les réponses métaboliques adéquates. Parmi ces systèmes, les kinases à sérine/thréonine (STPKs) jouent un rôle central dans la régulation de la physiologie bactérienne. Chez Mycobacterium tuberculosis, PknG se distingue par sa conservation au sein des Actinobactéries. Elle est activée par autophosphorylation dans une cascade de signalisation sensible aux nutriments. Les composants de ce système ' capteur (GlnH), transducteur (GlnX) et effecteur (PknG) ' sont conservés parmi les Actinobactéries, dont M. tuberculosis. Toutefois, les mécanismes moléculaires d'activation de PknG par les acides aminés demeurent méconnus.Une fois activée, PknG phosphoryle GarA, un régulateur qui oriente les flux carbone/azote selon les besoins cellulaires. Chez M. tuberculosis, GarA non phosphorylée inhibe la glutamate déshydrogénase (GDH), enzyme unique et NAD-dépendante appartenant à la famille des grandes, dites "Large", GDH (L-GDH), encore peu caractérisée. Dans cette étude, nous nous focalisant sur la caractérisation structurale de la L-GDH de M. tuberculosis. Au-delà de la résolution structurale, nos objectifs visent à explorer la dynamique des domaines et les mécanismes régulateurs, en particulier l'inhibition par GarA. Nous avons obtenu une structure cristalline révélant le site de liaison au NAD localisé dans le domaine catalytique, au sein du sous-domaine DNBD, caractéristique partagée avec les GDH canoniques. Cette structure correspond à un assemblage dimérique, ce qui concorde avec notre hypothèse selon laquelle la délétion de la région N-terminale, probablement impliquée dans l'assemblage tétramérique, induirait une modification de l'état oligomérique. Nos analyses par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) ont montré que GarA interagit avec la GDH non seulement via son domaine FHA en C-terminal, mais également via son segment N-terminal intrinsèquement désordonné, qui engage des contacts intersous-unités entre le DNBD du domaine catalytique de la GDH et le protomère en face, et qui adopte une conformation hélicoïdale lors de sa liaison. Notre hypothèse suggère une modulation allostérique de la GDH par GarA via une altération de la dynamique stabilisant un état enzymatique inactif. La comparaison en conditions 'steady-state' de l'effet de GarA entière par rapport aux mutants en N-terminal a révélé que la forme entière exerce un effet inhibiteur bien plus important que le domaine FHA seul, soulignant le rôle essentiel du segment N-terminal dans la régulation. Par ailleurs, nos résultats ont montré qu'en conditions d'activité optimale, l'ajout de GarA induit un passage d'une forme dimérique labile à une forme tétramérique monodisperse. Cela suggère un mécanisme par lequel GarA stabiliserait une forme moins active de GDH, présumée être le tétramère. Notre laboratoire a également identifié la coenzyme A comme un inhibiteur de la GDH. Les analyses par Cryo-EM et par ultracentrifugation analytique ont montré que celle-ci stabilise également la forme tétramérique de l'enzyme. Ces données soutiennent l'hypothèse d'un mécanisme d'inhibition convergent, dans lequel GarA et la coenzyme A exercent leurs effets en modulant la dynamique structurale de la GDH et en favorisant un état oligomérique moins actif. Enfin, l'ajout du substrat glutamate a révélé une conformation distincte du tétramère de GDH. Notre analyse par Cryo-EM a mis en évidence une structure tétramérique nettement ouverte, contrastant avec la conformation fermée observée en présence de GarA ou de la coenzyme A. Ce changement structural pourrait refléter un mécanisme régulatoire dynamique, dans lequel la GDH passerait d'une forme dimérique active à un tétramère ouvert, qui adopterait ensuite une conformation fermée sous conditions inhibitrices.