Quantitative evanescent-field imaging : smart surfaces and concurrent sample-plane and back-focal plane image analysis

Imagerie quantitative en champ évanescent : surfaces intelligentes et analyse simultanée d’images du plan d’échantillonnage et du plan focal arrière Les ondes évanescentes sont un phénomène se produisant dans divers régimes, tels que la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), les pertes de fibres optiques ou la polariton plasmonique de surface (SPP). Cette thèse étudie l'utilisation d'ondes évanescentes pour des techniques d'imagerie avancées via des «surfaces intelligentes», qui couplent la lumière aux SPP ou qui permettent la quantification des paramètres du fluorophore, comme l'orientation ou la distance par rapport à l'interface réfléchissante, en microscopie TIRF. Les deux approches utilisent des informations en champ proche sur les surfaces étudiées à l'aide de l'optique en champ lointain. Partie I : Génération de deuxième harmonique et polaritons de plasmons de surface : Un système d'excitation à deux photons a été développé pour la détection de la génération de seconde harmonique (SHG) afin d'explorer les caractéristiques d'émission non linéaires des SPP. En me concentrant sur les métasurfaces nanostructurées produisant des ondes évanescentes SPP et leur réponse SHG, je démontre une technique de caractérisation de surface. Des expériences menées sur des films d'argent métalliques lisses entourés de nanocavités ont révélé une amélioration significative du SHG, avec une augmentation observée dépassant un ordre de grandeur par rapport aux surfaces d'argent adjacentes. Les mesures optiques linéaires et l'imagerie par cathodoluminescence corroborent ces résultats, indiquant que les modes plasmoniques des bords des nanocavités se propagent et génèrent du SHG par annihilation sur le film lisse suggéré comme mécanisme sous-jacent. L'intensité et l'emplacement de ces points chauds SHG peuvent être contrôlés dynamiquement en ajustant la polarisation du champ incident, ouvrant ainsi de nouvelles possibilités d'applications en photocatalyse, en spectroscopie monomoléculaire ou en imagerie de surface non linéaire. Partie II : Microscopie TIRF et fluorescence à angle supercritique. J'ai développé et appliqué une combinaison TIRF et fluorescence à angle supercritique (SAF), conçue pour des transitions rapides entre l'imagerie du plan d'échantillonnage (SP) et du plan focal arrière (BFP), orientée vers la microscopie biologique. En analysant les informations des images SP et BFP, je récupère des informations autrement non accessibles sur les fluorophores et leur micro-environnement local. Les images BFP fournissent des informations sur l'indice de réfraction de l'échantillon et le positionnement axial des émetteurs par rapport à l'interface. Une partie importante de mon travail consistait à développer des algorithmes pour l'analyse d'images BFP et à étudier comment différents paramètres de configuration et d'expérimentation affectent les résultats obtenus. Je montre que, contrairement aux images SP, les images BFP sont très résilientes à la dérive focale, mais elles présentent une sensibilité à l'inclinaison de la pointe de la lamelle. Il a été démontré que les techniques de regroupement adaptatif améliorent considérablement le rapport signal/bruit et atténuent le grossissement des vides lors de l'alternance entre les modes d'imagerie SP et BFP. Dans des conditions de faible luminosité typiques de l'imagerie accélérée d'organites cellulaires sombres, les rapports d'intensité du SAF à la fluorescence à angle sous-critique (UAF) dépendent de la distribution axiale précise des fluorophores, ainsi que du mode d'éclairage et de l'évanescence. profondeur de pénétration des vagues. Cette découverte souligne les avantages synergiques de la combinaison de l'excitation TIRF avec la détection SAF pour une coupe optique supérieure. Les deux parties de mon travail consistaient à construire le système optique et à concevoir une interface utilisateur graphique (GUI) pour le contrôle du système, l'automatisation des protocoles de mesure et la gestion des données afin de faciliter l'utilisation par des chercheurs non experts d'autres disciplines (biologie et chimie).