Contributions à une ingénierie efficace des polycétide synthases

Face à la propagation de l'antibiorésistance et autres mécanismes de résistance, et au développement de nouvelles pathologies, la recherche de biomolécules innovantes et leur optimisation est un enjeu de santé majeur. Les polycétides sont une source inestimable de composés d'intérêts en médecine et en agriculture, car ils possèdent un large éventail de structures et de propriétés. Ils sont produits par des animaux, des plantes et des champignons, mais les plus grands producteurs de polycétides sont les bactéries du genre Streptomyces. Une stratégie prometteuse pour obtenir de nouvelles biomolécules est de modifier les enzymes responsables de leur production : les polycétide synthases (PKS). L'organisation particulière des PKS de type I modulaires en font des sujets d'études intéressants. Elles sont organisées en complexes de plusieurs chaînes polypeptidiques appelées sous-unités, composées de modules comprenant différents domaines. Ces sous-unités interagissent via des domaines de docking (DD). Le nombre, la composition et l'organisation des modules permet de déterminer la structure du squelette polycétidique. Cette règle de colinéarité a inspiré des décennies de tentatives d'ingénierie pour obtenir et optimiser de nouvelles biomolécules. Cependant, ces tentatives ont très souvent conduit à l'obtention de systèmes modifiés dont les rendements de production de dérivés de polycétides étaient bien plus faibles que les rendements obtenus avec le complexe enzymatique parental, voire inexistant. La majorité des sous-unités caractérisées sont composées d'un nombre restreint de modules. Cette observation nous a conduit à l'hypothèse que cet arrangement pourrait être un avantage évolutif, par la flexibilité que cela leur confère au sein des cellules. Le premier objectif de cette thèse a donc été d'investiguer la scission de grandes sous-unités de PKS en deux comme manière d'augmenter les rendements de production. Pour cela, deux systèmes PKS ont été étudiés : 1) la rapamycine synthase retrouvée chez S. hygroscopicus dont la sous-unité B, composée de 6 modules, a été scindée par l'introduction de DD exogènes entre les modules 3 et 4. Dans ce cadre, les vecteurs d'édition génétique ont été construits et les interactions entre les DD natifs et insérés ont en partie pu être caractérisées, afin d'assurer l'absence d'interaction non canonique ; 2) la stambomycine synthase de S. ambofaciens dont la sous-unité 3, composée de 5 modules, a été scindée en insérant une interface d'interaction synthétique formée de Synthetic Zippers (SynZips) entre les modules 2 et 3. Cette modification génique a été appliquée à la souche exprimant la PKS sauvage, ainsi qu'à une souche mutante codant une PKS miniaturisée synthétisant des mini-stambomycines. Ici, les souches nécessaires à l'étude de la productivité de PKS scindées ont été obtenues, et leurs analyses sont en cours. Un autre frein aux tentatives d'ingénierie des PKS modulaires est leur macro-complexation. En effet, la sous-famille des PKS trans-AT a été caractérisée comme formant des macro-complexes proches de la membrane bactérienne. Les motifs identifiés comme pouvant permettre cette macro-organisation étant absents de la sous-famille des PKS cis-AT, et aucune étude n'ayant été menée sur ces systèmes, leur localisation et organisation au sein de leur hôte bactérien reste à ce jour inconnue. Le second objectif de cette thèse a donc été de localiser et observer l'organisation de la coelimycine synthase, retrouvée chez S. coelicolor. Le marquage des enzymes de ce complexe par des protéines fluorescentes, couplé à de la microscopie confocale, a permis d'établir que les première et dernière sous-unités forment des foci qui colocalisent au sein d'îlots d'hyphes bactériens dans la colonie. Le transporteur associé est quant à lui retrouvé au niveau de la membrane des hyphes de toute la colonie. Ces résultats permettront par la suite d'investiguer les bases moléculaires à l'origine une telle organisation.