Production and characterisation of extracellular vesicles for therapeutic applications

Production et caractérisation de vésicules extracellulaires à visée thérapeutique La production à grande échelle de vésicules extracellulaires (VEs) constitue un enjeu majeur pour leur utilisation clinique. Notre laboratoire a développé une méthode compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication, reposant sur un flux turbulent dans des bioréacteurs contenant des cellules souches mésenchymateuses humaines issues du tissu adipeux (hASC) cultivées sur microporteurs. Ce procédé offre un fort rendement tout en préservant la viabilité cellulaire et le potentiel thérapeutique, notamment pour les fistules de la maladie de Crohn. Néanmoins, les mécanismes responsables des effets bénéfiques de ces VEs restent à élucider. Pour garantir la reproductibilité du processus de production, une standardisation du protocole a été mise en place, ainsi qu'une méthode de purification par filtration à flux tangentiel (TFF), plus adaptée que l'ultracentrifugation. La TFF permet de purifier et concentrer les VEs efficacement (récupération >70 %, concentration ×30), en éliminant les composants du milieu tout en conservant les biomolécules d'intérêt. Une caractérisation moléculaire et fonctionnelle des VEs produites par turbulence a été réalisée, comparée à celle de VEs obtenues par carence cellulaire en culture 2D. La production turbulente montre une meilleure pureté (moins de protéines libres), évaluée par le ratio particules/protéines. Le fractionnement par A4F, combiné à des dosages protéiques et particulaires, a permis d'identifier deux fractions : l'une riche en protéines solubles, l'autre en VEs. Un test d'immunogénicité utilisant la lignée THP1-Dual a révélé que les protéines solubles étaient principalement responsables des effets inflammatoires, et que les VEs issues de la turbulence étaient globalement moins immunogènes que celles produites par carence. Nous avons aussi évalué le potentiel thérapeutique des VEs dans des modèles de pathologies pulmonaires, notamment le SDRA. Les VEs ont restauré la prolifération de cellules endothéliales humaines après inflammation. Leur effet anti-inflammatoire sur des macrophages a été modéré mais renforcé par le prétraitement des hASC avec des nanoparticules de fer ou des sels d'or. Les VEs ont aussi favorisé la régénération de la production de surfactant d'organoïdes alvéolaires, bien que des limites techniques aient conduit au développement d'un dispositif microfluidique pour fiabiliser ces tests. Dans le projet EXCELLDISC, nous avons étudié l'effet des VEs sur des modèles de dégénérescence du disque intervertébral. Les VEs augmentent l'activité métabolique des cellules, mais aussi l'expression de gènes pro-cataboliques. Une étude de l'absorption a montré une captation préférentielle des VEs par les cellules du noyau pulpeux, avec un effet de saturation à fortes doses. En résumé, cette méthode de production par turbulence permet une production efficace et moins immunogène de VEs, avec un potentiel thérapeutique prometteur dans diverses pathologies inflammatoires et dégénératives.