Développement de capteurs à ARN sans amplification génique par l'exploitation des enzymes CRISPR-Cas13a en combinaison avec les transistors graphène à grille électrolytique

La détection et la quantification de l'ARN sont extrêmement utiles pour identifier les infections par des virus à ARN, comme l'illustre la pandémie causée par le SARS-CoV-2 en 2019. Elles sont également utilisées pour surveiller la prolifération bactérienne dans l'eau et les aliments, après une infection chez l'homme ou l'animal, ou encore pour suivre l'évolution des maladies dans lesquelles des miARNs sont produits. Toutefois, la mise au point d'une méthode d'identification d'agents pathogènes extrêmement sensible et rapide sans amplification génique par PCR reste un problème profondément ancré. Le développement de dispositifs de détection d'acides nucléiques sans amplification génique préalable peut être axé sur les systèmes CRISPR-Cas13a. Ces particules ribonucléiques sont composées de deux parties : une protéine Cas et un ARNcr (ou ARN CRISPR). Ce dernier a pour but de fixer la séquence spécifique d'ARN à détecter par hybridation, ce qui déclenche une activité RNAse (RiboNucléAse) par le biais d'un changement conformationnel de Cas13a. Cette activité RNAse permet de décupler le signal perçu, avec une seule enzyme activée pouvant mener à l'hydrolyse de 10 000 sondes ARNs. La mesure de cette activité RNAse permet ensuite de quantifier la concentration en ARN. RiboNucléAse) par le biais d'un changement conformationnel de Cas13a. Cette activité RNAse permet de décupler le signal perçu, avec une seule enzyme activée pouvant mener à l'hydrolyse de 10 000 sondes ARNs. La mesure de cette activité RNAse permet ensuite de quantifier la concentration en ARN. Dans ces travaux, nous présentons deux dispositifs pour la détection d'ARN. Le premier, nommé CRISCOFET, et incorpore le système CRISPR-Cas13a dans une plateforme de transistor à effet de champ à grille électrolytique (EGFET) à base d'oxyde de graphène réduit (rGO). Le capteur CRISCOFET exploite le couplage capacitif d'un rGO-EGFET pour traduire l'activité enzymatique de CRISPR-Cas13a en un signal électrique prêt à l'emploi. Pour cela, le canal rGO du transistor est fonctionnalisé par des nanoparticules d'or sur lesquelles des séquences d'ARN riches en nucléotides U sont immobilisées de manière covalente. Le principe de détection est basé sur le clivage enzymatique de ces séquences ARNs riches en nucléotides U lorsqu'elles sont exposées au complexe CRISPR-Cas13a activé. Cet évènement d'hydrolyse induit un dopage de type p qui se manifeste par un décalage positif du point de neutralité des charges du rGO. En utilisant l'ARN cible nCoV-2 et son ARNcr associé comme modèle, le dispositif CRISCOFET montre une capacité de détection et de quantification d'ARN importante, avec une réponse linéaire du capteur pour des concentrations en ARN cible entre 75 ng.μL-1 et 75.10-9 ng.μl-1 en 30 minutes. Le deuxième dispositif, encore en phase de développement, exploite les propriétés de progression d'un liquide dans un microcanal en fonction des propriétés de mouillage du substrat, où la présence d'une surface hydrophobe bloque l'avancée spontanée du liquide dans ce dernier. Ainsi, des couches hydrophobes composées de duplex ADN-ARN ont été élaborées sur des surfaces d'or et de polydopamine ; et dont l'hydrophobie est assurée par la présence d'un groupement cholestérol terminal sur l'ARN. L'hydrolyse des brins d'ARNs par l'enzyme Cas13a activée rend la surface hydrophile par séparation du cholestérol, ce qui permet de réenclencher la progression du liquide. De plus, ces dispositifs sont facilement programmables ; pour détecter différents ARNs cibles, seul le site de reconnaissance CRISPR doit être modifié (soit l'ARNcr), ce qui permet de maintenir la même activité enzymatique de Cas13a pour toutes les particules ribonucléiques synthétisées.