Biochemical properties and regulation of the TopoVI-like complex responsible for the initiation of meiotic recombination

Propriétés biochimiques et régulation du complexe TopoVI-like responsable de l'initiation de la recombinaison méiotique Afin de transmettre leurs informations génétiques d'une génération à l'autre, les organismes à reproduction sexuée doivent réduire de moitié leur contenu chromosomique pour former des gamètes haploïdes. Cette réduction se produit lors d'une division cellulaire appelée méiose, durant laquelle une étape de réplication est suivie de deux divisions successives, la méiose I et II. Au cours de la méiose I, les chromosomes homologues se séparent et leur bonne ségrégation dépend de la création entre eux d’un lien physique. En méiose c’est le processus de réparation appelé recombinaison homologue, qui à la suite de l’induction dans le génome de centaine de cassures double brin par la protéine Spo11, permet d’établir ce lien. Spo11 est l'orthologue méiotique de la sous-unité catalytique de la topoisomérase VI, TopoVIA. Comme TopoVI est composée de deux sous-unités, TopoVIA et TopoVIB, l’existence d’un orthologue méiotique de TopoVIB était une question posée depuis l'identification de Spo11. Au cours de ma thèse, j'ai contribué à identifier une nouvelle famille de protéine, que l’on a nommé TopoVIB-like, orthologue à TopoVIB et nécessaire à la formation des cassures double-brin d'ADN méiotiques(Robert et al, 2016). Ces protéines ont des domaines similaires à ceux de TopoVIB, à savoir un GHKL (impliqué dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP), un domaine transducteur et un domaine CTD. Nous avons démontré que chez la souris, SPO11 forme un complexe avec TOPOVIBL. De plus, nous avons démontré que cette protéine est nécessaire à la formation des CDB. Ces résultats suggèrent que chez la souris, les CDB méiotiques sont catalysées par un complexe TopoVI-like. Chez S. cerevisiae, il n'y a pas d'orthologue clair de TopoVIB, mais nous avons trouvé que la protéine Rec102, connue pour être nécessaire à la formation des CDB méiotiques, présente une homologie partielle avec le domaine transducteur des TopoVIB-like. Rec102 forme un complexe avec Rec104, une protéine également requise pour la formation des CDB. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que le complexe Rec102 / Rec104 était l'orthologue méiotique de TopoVIB chez la levure, interagissant avec Spo11 pour former un complexe de type TopoVI-like. Malgré l'importance de Spo11, son mode d'action est mal connu. Cette absence de données biochimiques est due à l’insolubilité de la protéine. Le but de ma thèse était de caractériser le mode d'action et la régulation du complexe TopoVI-like dans la formation des CDB méiotiques. Tout d'abord, biochimiquement, en purifiant in vitro une forme soluble du complexe TopoVI-like de levure composé de Spo11 / Rec102 / Rec104 / Ski8 (un partenaire direct de Spo11) en co-exprimant ces protéines dans deux systèmes d'expression, E. coli et S. cerevisiae. En utilisant E. coli, j'ai réussi à purifier un complexe soluble formé par Spo11 / Rec102 / Rec104 / Ski8 et en utilisant S. cerevisiae, j'ai purifié deux complexes différents, l'un formé par les quatre protéines, et un formé uniquement par Spo11 et Rec102. Néanmoins, les tests d'activité sur différents substrats d'ADN n'ont révélé aucune activité de coupure de l’ADN. Le deuxième objectif de ma thèse était d'étudier comment, chez la souris, TOPOVIBL régule l'activité de SPO11 en interagissant avec d'autres protéines nécessaires à la formation des CDB. En double hybride, j'ai prouvé que, comme chez la levure, l'orthologue méiotique de TopoVIB chez la souris interagissait avec REC114, une autre protéine nécessaire à la formation des CDB. La cartographie de cette interaction à l'échelle de l’acide aminé a conduit à l'identification d'un résidu sur TOPOVIBL essentiel pour l'interaction entre TOPOVIBL et REC114. Afin d'étudier in vivo le rôle de l'interaction entre TOPOVIBL et REC114, une souris mutante pour le résidu identifié de TOPOVIBL a été générée à l'aide de CRISPER-Cas9 et son phénotype a été analysé.