RNAi and Chemical-Based High Content Screening for the Normalization of XPC Phenotyope

Criblage à haut contenu à base d'ARNi et de produits chimiques pour la normalisation du phénotype XPC La Xeroderma Pigmentosium C (XP-C) est une génodermatose autosomique récessive rare. Les patients de cette pathologie sont porteurs d'une mutation dans la protéine XPC de reconnaissance des dommages de l'AND. Cette mutation génère un phénotype pathologique caractérisé par une photosensibilité extrême et l'accumulation de dommages à l'ADN induits par les UV. Par conséquent, l'objectif de ce projet est de cribler des molécules chimiques et biologiques afin d'identifier les hits qui peuvent inverser ce phénotype malade. Des cellules XP-C et normales dérivées de patients seront utilisées pour cribler une bibliothèque chimique de 1280 médicaments approuvés par la FDA ou une bibliothèque de siRNA visant à diminuer l'expression de toutes les kinases humaines, étant donné l'implication des kinases dans les différentes voies de réparation de l'ADN. Les cellules seront ensuite irradiées par des UVB pour induire des lésions de l'ADN, puis l'inversion phénotypique sera surveillée au niveau de la photosensibilité ou au niveau de la réparation des lésions de l'ADN pour visualiser quel traitement permet une diminution du niveau de lésions et donc une réparation. Une caractérisation plus poussée des effets des hits sera ensuite effectuée au niveau de l'apoptose et de la prolifération, par cytométrie de flux, et de la signalisation en aval via le western blot. Pour le criblage chimique, 1280 médicaments différents ont été utilisés pour traiter les cellules. Après l'induction de dommages à l'ADN, les cellules ont également été post-traitées avec les mêmes médicaments, puis incubées pendant vingt-quatre heures pour permettre leur récupération. La viabilité des cellules traitées a été. Seize médicaments ont permis une augmentation de plus de 25% de la viabilité des cellules. Ensuite, après le marquage des dommages à l'ADN et leur quantification, deux médicaments, l'isoconazole et le chlorhydrate de clemizole, ont permis de diminuer de 20% la quantité de dommages à l'ADN. L'un des deux médicaments, l'isoconazole, a permis de réduire la mort apoptotique des cellules XPC mais n'a eu aucun effet sur leur taux de prolifération. Le mode d'action connu des deux médicaments sélectionnés est un antifongique pour l'isoconazole et un antagoniste des récepteurs de l'histamine pour le chlorhydrate de clémizole. Cela n'explique pas leurs effets dans la protection des cellules XPC contre la mort induite par l'irradiation. Par conséquent, une étude plus approfondie du mécanisme d'action possible est nécessaire en comparant le profil d'expression des protéines des cellules traitées et non traitées afin d'identifier un nouveau mécanisme d'action possible pour ces deux médicaments. Quant à criblage biologique, une bibliothèque de siRNAs ciblant l'ensemble des kinases humaines a été utilisée pour traiter les XPC et les cellules normales, puis pour détecter si une inversion phénotypique se produit. 1292 siRNA différents ont été utilisés pour traiter les cellules XPC afin de les irradier et leur permettre de récupérer pendant 24 heures avant de mesurer leur viabilité. Vingt-huit siRNA différents ont été sélectionnés sur la base de leur capacité à induire une augmentation de 25 % de la viabilité cellulaire. Parmi eux, le ciblage de deux kinases a permis une réparation de 20% des dommages induits à l'ADN. Une kinase en particulier a eu un effet exclusif dans la photo-protection des cellules XPC et aucun effet sur les cellules normales. Le knock down de l'expression de la kinase induit par ce siRNA a été validé au niveau de l'ARNm par PCR et au niveau de la protéine par western blot. L'effet photo-protecteur de ce knock down de la kinase dans les cellules XPC a également été validé dans un test de réponse aux UVB. Le XPC est un excellent modèle pour comprendre l'initiation du cancer de la peau, car il est accéléré dans ces cellules. En améliorant ce phénotype, nous pouvons donc trouver des moyens de retarder ou de prévenir l'initiation du cancer.