Characterization of the viral replicase of hepatitis E virus

Caractérisation de la réplicase du virus de l'hépatite E Le virus de l'hépatite E (VHE) est la principale cause d'hépatite aiguë dans le monde. Actuellement, aucun traitement antiviral efficace contre le VHE n'est disponible et un vaccin contre le VHE n'est disponible qu'en Chine. Le VHE est un virus à ARN simple brin de polarité positive exprimant 3 cadres de lecture ouverts (ORF). L'ORFI code pour la polyprotéine non structurale ORF1, ou réplicase virale, qui transcrit le génome complet et un A RN sous-génomique qui code pour les protéines structurales ORF2 et ORF3. Notre objectif est de mieux caractériser l'ORFI : déterminer si cette protéine subit une maturation au cours du cycle viral et identifier le compartiment de réplication du VHE.Comme aucun anticorps commercial ne reconnaît l'ORFI en système réplicatif, nous avons cherché à insérer des épitopes dans la séquence ORF1 de la souche p6 de génotype 3 qui a été sélectionnée en culture cellulaire.Tout d'abord, un réplicon du VHE où le gène rapporteur Gaussia luciférase se trouve sous le contrôle de l'ORFI a été utilisé pour évaluer l'efficacité de réplication du génome étiqueté. L'insertion de 2 étiquettes V5 dans la région hypervariable n'a paseu d'impact significatif ni sur la réplication du génome ni sur la production d'ARNsous-génomique, alors que l'insertion d'un épitope HA à l'extrémité C-terminale de l'ARN polymérase ARN-dépendante a réduit la production d'ARN sous-génomique.Des étiquettes ont ensuite été insérées à la fois dans le génome infectieux p6 HEV complet et dans l'ORFI exprimée de manière hétérologue. Des analyses en Westernblot et par immunoprécipitation de l'ORFI étiquetée et exprimée dans les 3 systèmes ont révélé la présence d'une protéine de poids moléculaire élevé (>180kDa) qui correspond probablement à la forme ORF1 de pleine longueur. Celle-ci a pu être détectée jusqu'à 25 jours après électroporation de l'ARN infectieux p6 dans les cellulesPLC3.En outre, les protéines de poids moléculaires inférieurs (90-180kDa) ont été détectées en plus faible abondance, ce qui suggère que l'ORFI est clivée. Des analyses par spectrométrie de masse ont été réalisées pour identifier la séquence des produits de clivage potentiels. Il apparaît que l'extrémité N-terminale de toutes les protéines étiquetées V5 de faible poids moléculaire est stable et correspond à l'extrémité N -terminale de la protéine entière.Cependant, l'extrémité C-terminale n'a pas encore été identifiée. De façon intéressante,l'analyse par western blot des fractions subcellulaires ainsi que la microscopie confocale ont révélé une localisation cytoplasmique et nucléaire de l'ORFI étiquetée,indiquant que l'ORFI pourrait être transloquée dans le noyau pendant l'infection.Enfin, nous avons utilisé la technique RNA scope pour localiser l'ARN du VHE à l'intérieur de la cellule hôte. Les sondes ont été conçues pour s'hybrider spécifiquement aux brins positif et négatif de l'ARN du VHE. L'ARN génomique et subgénomique ont été localisés à proximité les uns des autres ainsi que des protéines virales dans des structures périnucléaires qui pourraient représenter les complexes de réplication du VHE.