Biodiversity, mechanism, and substrate specificity of fatty acid photodecarboxylase

Biodiversité, mécanisme et spécificité de substrat de l'acide gras photodécarboxylase Les hydrocarbures (alcanes, alcènes), sont des molécules composées uniquement d'atomes d'hydrogène et de carbone qui font partie intégrante des besoins quotidiens de l'homme. En effet, ils sont les composés de base des carburants et sont utilisés en chimie, comme solvants et lubrifiants, ainsi qu'en cosmétique. La quasi-totalité des hydrocarbures que nous utilisons aujourd'hui sont d'origine fossile mais des voies de biosynthèse d'hydrocarbures à partir des acides gras existent dans de nombreux organismes. Malheureusement, ces enzymes ont souvent un faible rendement et nécessitent des conditions catalytiques difficiles à mettre en œuvre dans l'industrie. Ainsi, la compréhension des mécanismes des enzymes formant des hydrocarbures et leur ingénierie ont fait l'objet de nombreux travaux au cours des dix dernières années. La dernière enzyme formant des hydrocarbures à avoir été découverte (en 2017) est l'acide gras photodécarboxylase (acronyme anglais : FAP), une protéine que l'on ne trouve que dans les algues. Cette enzyme est particulièrement intéressante car sa réaction ne nécessite pas de donneurs d'électrons mais seulement un photon à chaque cycle catalytique. Il s'agit donc d'une photoenzyme, un type d'enzyme très rare. La FAP a suscité beaucoup d'intérêt en biocatalyse. Mon travail de doctorat avait trois objectifs : (i) Déterminer si l'activité de la FAP est conservée dans les algues au-delà de l'algue verte modèle Chlorella variabilis NC64A où elle a été découverte, et voir si d'autres FAP putatives sont susceptibles d'avoir une spécificité d'acide gras différente de la FAP de Chlorella variabilis (CvFAP) ; (ii) Participer à une vaste étude pluridisciplinaire impliquant un consortium international de laboratoires et visant à mieux comprendre la structure et le mécanisme de la CvFAP; (iii) Étudier la spécificité des acides gras de la CvFAP en mettant l'accent sur les acides gras à chaîne courte et moyenne, considérés comme de mauvais substrats pour la FAP. Dans la première partie, j'ai exprimé dans E. coli sept homologues de la CvFAP provenant de divers groupes d'algues et j'ai pu obtenir une FAP active soluble pour quatre d'entre eux : Les FAP d'Ectocarpus siliculosus (macroalgue brune), de Chondrus crispus (macroalgue rouge), de Nannochloropsis gaditana (microalgue proche des algues brunes) et de Galdieria sulphuraria (microalgue rouge) se sont révélées avoir une activité FAP conservée mais avec des spécificités d'acides gras distinctes. Dans la deuxième partie, j'ai participé à la production et à la purification de la CvFAP à grande échelle pour différentes approches biophysiques. J'ai réalisé des expériences biochimiques, de cristallographie statique et de spectroscopie d'absorption transitoire sur la CvFAP et sur un mutant (R451K) important pour la stabilisation du substrat. L'ensemble de l'étude a permis d'élucider tout le mécanisme de la CvFAP. Dans la troisième partie, j'ai étudié l'activité de la CvFAP in vitro et montré qu'elle peut convertir l'acide n-octanoïque quatre fois plus vite que l'acide n-hexadécanoïque, son meilleur substrat rapporté à ce jour. J'ai également montré qu'in vivo, cela se traduit par un taux de production (basé sur la CvFAP) plus de dix fois supérieur pour le n-heptane que pour le n-pentadécane. Les expériences de spectroscopie résolue dans le temps que j'ai réalisées en collaboration ont prouvé que la forte activité catalytique de la FAP sur l'acide n-octanoïque est en partie due à un effet autocatalytique de son produit, le n-heptane, qui remplit le reste de la cavité du site actif de la CvFAP. Enfin, j'ai déterminé l'effet de la concentration en substrat, du pH et de l'intensité lumineuse sur l'activité de la CvFAP pour la conversion des acides n-hexanoïque et n-butanoïque. Ces résultats devraient guider les futures stratégies de sélection, d'amélioration et d'utilisation de la FAP pour la production à la lumière d'hydrocarbures à chaîne courte ou moyenne.