Rôle et origine de l'ADN extracellulaire dans la production et la structure des biofilms de Clostridioides difficile

Clostridioides difficile est une bactérie à Gram positif, strictement anaérobie, sporulée, responsable d'infections intestinales nosocomiales et communautaires. Le problème majeur des infections à C. difficile est la survenue de récidives, dans 15 à 25 % des cas après un premier épisode, dont plus de la moitié sont des rechutes, liées à la même souche. Ces récidives sont dues à la capacité de la bactérie à persister dans le tube digestif, notamment sous forme de spores et éventuellement sous forme de biofilm. Bien qu'il n'y ait pas à ce jour de preuve formelle de la formation d'un biofilm de C. difficile in vivo, il existe des arguments en faveur de cette hypothèse. C. difficile est capable de former des biofilms in vitro, de biomasses variables selon les souches.Les objectifs de la thèse étaient de caractériser l'architecture globale et la matrice des biofilms formés par 4 souches de C. difficile, choisies sur leur capacité différente à former des biofilms : la souche clinique R20291, la souche de laboratoire 630∆erm, dérivée d'une souche clinique, et deux mutants de surface 630∆erm∆fliC (mutant immobile) et 630∆erm∆cwp84 (mutant présentant une couche S altérée). En mesurant la proportion des composants principaux de la matrice de biofilms âgés de 48 h (polysaccharides, protéines, ADN extracellulaire), nous avons montré que les polysaccharides sont les composants majoritaires de la matrice des biofilms produits par les 4 souches, devant les protéines et l'ADNe, qui représente moins de 10 % de ces trois composants. La caractérisation fine de la localisation de ces composants et de leurs interactions a nécessité une importante mise au point des marquages fluorescents pour la microscopie confocale à balayage laser. Nous avons montré que la structure tridimensionnelle des biofilms de C. difficile est hétérogène. Ils sont constitués de bactéries mortes à la base du biofilm et des bactéries vivantes à la surface, engluées dans une matrice exopolymérique autoproduite. Au sein de cette matrice, nous avons observé, pour la première fois chez C. difficile, de fins filaments d'ADNe reliant les bactéries entre elles, formant un réseau évoquant une structure de toile d'araignée et donc impliqués dans l'agrégation des bactéries et la cohésion du biofilm. Ce résultat est cohérent avec la dispersion du biofilm observée suite à la dégradation de l'ADNe par la DNase I, avec un taux variable en fonction des souches. Ainsi, bien que l'ADNe soit un élément minoritaire de la matrice, c'est un élément clé de l'agrégation bactérienne et de la cohésion des biofilms. D'autres composants, notamment le polysaccharide II et la lipoprotéine CD1687, qui sont deux composants de la surface bactérienne, présentent une colocalisation en microscopie confocale avec les filaments d'ADNe, plus ou moins importante selon les souches. Leur abondance dans la matrice semble corrélée à la robustesse et la cohésion du biofilm de C. difficile, suggérant que ces composants stabilisent le réseau d'ADNe. Des lipides et des protéines sont également présents au sein de cette matrice, mais ne sont pas ou très peu colocalisés avec l'ADNe.Nous avons également cherché à identifier le ou les mécanismes pouvant être mis en jeu pour la libération des composants de la matrice produits par les bactéries. Des études précédentes avaient suggéré que l'autolyse pouvait jouer un rôle dans ce processus. Notre étude n'a pas retrouvé de corrélation entre la capacité d'autolyse induite par le Triton X-100 et la capacité des 4 souches testées à produire des biofilms, et des mutants de l'autolysine Cwp19, construits pour cette étude, ne produisent pas moins de biofilm que leur souche parentale. Enfin, des structures évoquant des vésicules extracellulaires au sein de la matrice ont été visualisées en microscopie confocale, mais leur nature devra être confirmée.