Development of lc-ms method to identify triacylglycerols in resinous seed oils

Développement de méthodes LC-MS pour l'identification des triglycérides dans les huiles de graines de résineux Cette thèse a consisté à développer une nouvelle stratégie analytique en utilisant le couplage chromatographie liquide - spectrométrie de masse (LC-MSn) afin d’identifier dans les huiles et corps gras, les triglycérides (TAGs) et leur régio-spécificité. Cette méthodologie analytique générale a été appliquée à 8 huiles de graine de résineux en particulier, à l’huile de pignon de Pinus Koraiensis car ses TAGs sont constitués d’acides gras, possédant une double liaison en position Δ5, non-méthylène alternée, susceptibles de jouer un rôle anti-cholestérol chez l’homme.La thèse se décompose en quatre chapitres: les deux premiers, bibliographiques, traitent respectivement de la taxonomie des 8 résineux étudiés, de la composition en acide gras (AG) de leur graine et des techniques analytiques déjà décrites pour caractériser les TAGs. Le troisième chapitre, expérimental, est dédié au développement de nouvelles stratégies analytiques NARP-LC-MSn mises en place pour identifier les TAGs présents dans les huiles et plus particulièrement à l’huile de pignon de Pinus Koraiensis. Grâce à l’ajout post colonne de sel d’argent, il a été possible de déterminer de manière non ambigüe la structure de tous les TAGs d’un lipide, même ceux présents en faible quantité, par Ag+-NARP-LC-MS mais aussi de déterminer la structure de chaque AG constitutif d’un TAG par fragmentation de l’adduit moléculaire par Ag+-NARP-LC-MS2. Le problème de la distinction des TAGs ayant la même masse moléculaire, les mêmes longueurs de chaine mais des positions de double liaisons différentes, a été résolu en développant une méthode d’identification des TAGs à partir des lois de rétention chromatographiques qui relient linéairement le logarithme du facteur de rétention de chaque TAG soit au nombre total de carbone soit au nombre total de double liaisons. Cette étude a permis d’identifier 22 nouveaux TAGs parmi un nombre total de 58 TAGs caractérisés. Elle a amené la preuve que le résidu AG saturé à 17 atomes de carbone est ramifié et non linéaire. Elle a mis en évidence la présence de trois AGs constitutifs qui n’ont jamais été décrit: 19:1, 19:2 et 24:0 dans l’huile de pignon de Pinus Koraiensis. Le quatrième chapitre porte sur le développement de trois méthodes de détermination de la régiospécificité des TAGs, grâce à la seule SM: (1) une méthode Ag+-NARP-LC-ESI-MS2 utilisant les rapports des ions diglycériques des TAGs. Il en ressort que cette méthode n’est pas assez fiable pour déterminer la structure des TAGs. (2) la seconde méthode fait appel à des expériences MS4/ MS5 sur les adduits argent des TAGs. Elle s’avère pertinente à condition d’avoir à disposition les couples de TAGs standards. (3) enfin une troisième méthode, utilisant la MS2, s’appuie sur le principe de la méthode de dissociation compétitive d’une paire [TAGref – Li -TAG]+. En utilisant la méthode des ajouts dosés il est montré qu’elle ne nécessite que de la disponibilité d’un seul des deux TAGs stéréoisomères comme standard.Ces méthodes originales ont permis, malgré leurs limites respectives de caractériser la régiospécificité d’un certain nombre de TAGs présents dans l’huile de graine de Pinus Koraiensis.