Etude de la dynamique des domaines de la NADPH-cytochrome P450 réductase humaine

La NADPH cytochrome P450 réductase (CPR) est une flavoprotéine multidomaines appartenant à la famille des diflavines réductases et un des composants essentiels du système redox des cytochromes P450. La CPR est formée de deux domaines catalytiques contenant des groupements prosthétiques FAD et FMN et d'un domaine de connexion. Le domaine FAD reçoit deux électrons du NADPH et les transfère un par un au domaine FMN, qui, à son tour, les transfère aux accepteurs. Le transfert d’électron du FMN vers les accepteurs nécessite un déplacement du domaine FMN par rapport au reste de la molécule. Au fils des années, les études structurales menées sur la CPR ont mis en évidence la réorganisation structurale et l’arrangement des domaines dans cette protéine. Cependant, les résultats de ces analyses ne fournissent pas d’informations concernant la vitesse à laquelle les mouvements des domaines de la CPR s’effectuent et n’incluent toujours pas les paramètres qui induisent le changement conformationnel ainsi que l'influence de ces changements sur l’activité catalytique de la CPR.Le projet de cette thèse a consisté à apporter de nouveaux éléments de compréhension sur la relation entre les changements conformationnels de la CPR et son cycle catalytique. La première partie de ce travail a porté sur le développement de stratégies de préparation au marquage des domaines catalytiques de la CPR, destinés à l’étude dynamique de cette protéine par le FRET. Différentes stratégies ont été envisagées parmi lesquelles l’incorporation de p-acétyle phénylalanine sur des positions définies dans la CPR. La deuxième partie de ce travail est consacrée à l’étude dynamique de la CPR via des techniques de RMN et SAXS combinées à des approches biochimiques. Les expériences menées ont permis de caractériser en solution et en absence de NaCl, la présence d’un état rigide, globulaire en conformation fermée dans laquelle les domaines FMN et FAD sont maintenus « verrouillés » par des interactions à l’interface entre ces deux domaines. L’augmentation de la concentration en NaCl permet une transition de cet état « verrouillé » vers un état plus ouvert pour lequel il n’y a plus d’interface entre les domaines FAD et FMN. L’état « déverrouillé » de la CPR correspond à un équilibre dynamique entre un ensemble de conformations en échange rapide. Cet équilibre est contrôlé par la force ionique et l’activité catalytique de la CPR est maximale lorsque les états verrouillés et déverrouillés sont également peuplés. Le modèle cinétique proposé par nos études a permis de mettre en évidence un lien direct entre la dynamique des domaines et l’activité du transfert d’électron au cours de cycle catalytique de la CPR.