Entwicklung eines CAR-T-Zell-basierten Agranulozytosemausmodells

Neutrophile Granulozyten bilden die erste Abwehrlinie des Organismus gegen Pathogene und Gewebeschäden. Sie migrieren entlang eines chemotaktischen Gradienten zum Ursprung der Entzündung und können durch ihre zytotoxischen Granula die Pathogene durch Phagozytose, Degranulierung und die Ausbildung von Neutrophil Extracellular Traps bekämpfen. Im Rahmen der Hämatopoese werden neutrophile Granulozyten im Knochenmark gebildet und bilden den größten Anteil der peripheren Leukozyten beim Menschen. Eine pathologische Verminderung wird als Neutropenie bezeichnet, deren schwerwiegendste Ausprägung die Agranulozytose ist. Dabei ist die Neutropenie selbst asymptomatisch und wird oftmals erst durch eine Anfälligkeit der Patienten für schwerwiegende bakterielle Infektionen identifiziert. Bei aktuellen Mausmodellen wird die Neutropenie im Blut mittels kontinuierlicher Applikation von depletierenden Antikörpern erreicht. Jedoch wird dadurch die Notfallgranulopoese aktiviert und nach 2 – 3 Tagen erreichen die neutrophilen Granulozyten wieder ihren Ausgangswert, oder es kommt sogar zu einer überschießenden Neutrophilie. Als eine dauerhafte Methode der Depletion sind in der Klinik chimäre Antigenrezeptor (CAR) T Zellen, die gegen B Zell Malignome gerichtet sind, zugelassen. Die gravierende Depletion der B Zellen zeigte, dass auch nicht maligne Zellen von CAR T Zellen erkannt und lysiert werden. Um einerseits eine dauerhafte Agranulozytose in Mäusen zu induzieren und andererseits das Limit von CAR T Zellen gegen eine sich schnell regenerierende und hochfrequente Zelllinie zu analysieren, wurden in der vorliegenden Arbeit auf Grundlage ebendieser Therapieform gegen neutrophile Granulozyten gerichtete CAR Konstrukte der zweiten Generation entwickelt. Das single chain variable fragment (scFv) wurde vom Antikörperklon RB6 8C5 abgeleitet und erkennt das murine Granulozytendifferenzierungsantigen 1 (Gr1). Nach Expression der CAR Konstrukte auf NK 92 Zellen, sowie auf primären humanen und murinen T Zellen konnte die Funktionalität des scFv zur Depletion muriner neutrophiler Granulozyten erfolgreich gezeigt werden. Das Lymphozytenantigen 6G, welches ausschließlich auf murinen neutrophilen Granulozyten exprimiert wird, wurde spezifisch durch das genierte CAR Konstrukt erkannt, wohingegen das Lymphozytenantigen 6C, dass auf Granulozyten, Monozyten und T Zellen exprimiert wird, nicht erkannt wurde. Während der in vitro Kultivierung zeigten die humanen und murinen T Zellen, unabhängig von der Expression eines CAR Konstrukts, eine durch die Aktivierung vermittelte Veränderung des T Zellphänotyps ausgehend von naiven T Zellen hin zu Zentralgedächtnis und Effektorgedächtniszellen. Der Gedächtnisphänotyp korreliert mit einer verbesserten Persistenz der CAR T Zellen, während Effektorzellen sich durch eine kurze Lebensdauer und eine hohe Zytotoxizität auszeichnen. In wildtypischen C57/BL6 Mäusen führte die Applikation der CAR T Zellen bereits nach einem Tag zu einer Reduktion der neutrophilen Granulozyten im Knochenmark einhergehend mit einem Anstieg der inflammatorischen Plasmazytokine. Die murinen CAR T Zellen, die bereits während der Kultivierung Anzeichen von T Zellerschöpfung zeigten, konnten nicht langfristig in vivo persistieren und keine dauerhafte Agranulozytose im Peripherblut und Knochenmark etablieren. Im Gegensatz dazu zeigten humane CAR T Zellen, die im Vergleich zu murinen CAR T Zellen langsamer erschöpfen, bis zu mindestens 28 Tage nach der Applikation in immunsuprimierten NSG Mäusen eine Persistenz im Knochenmark und der Milz, einhergehend mit einer Reduktion der neutrophilen Granulozyten im Peripherblut, sowie an ihrem Ursprungsort dem Knochenmark. Gr1 CAR T Zellen erlauben eine effiziente Depletion neutrophiler Granulozyten in vivo und bieten damit eine wertvolle Möglichkeit für zukünftige Analysen der neutropenischen Maus. Damit kann ein entscheidender Beitrag zu einem verbesserten Verständnis der Granulopoese, der Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen, sowie zur Analyse von Infektionsmodellen geleistet werden.