Understanding how coacervation of two viral proteins drives the formation of membrane-less compartments

Comprendre comment la séparation de phase de deux protéines virales entraîne la formation de compartiments sans membrane La transcription et la réplication du génome des virus à ARN nonsegmenté de polarité négative, dont le virus de la rage (RABV), se déroulent dans des organelles sans-membrane qui se forment dans le cytoplasme la cellule hôte par séparation de phase liquide liquide (appelés corps de Negri dans le cas du RABV). Ce processus physique, généralement induit par des interactions protéine-protéine ou protéine-acide nucléique, résulte dans la coexistence de deux phases liquides, sous forme de gouttelettes contenant une phase dense en protéine (condensat moléculaire) en suspension dans une phase diluée. Récemment, la découverte que de nombreuses organelles cellulaires normales ou pathologiques sont formées par un processus similaire de séparation de phase liquide-liquide a suscité un grand intérêt en biologie. Les mécanismes moléculaires sous-jacents et les forces impliquées dans ces processus restent néanmoins méconnus.Les objectifs de mon travail étaient (1) de reconstituer in vitro, à partir de protéines recombinantes purifiées, le processus de séparation de phase liquide-liquide induit par la phosphoprotéine et la nucléoprotéine du RABV et (2) d’étudier ce système par différentes méthodes biophysiques dont la diffusion de neutrons et de rayons X aux petits angles pour caractériser le mécanisme d’interaction et pour décrire les dimensions et la forme des protéines dans le condensat.Nous avons produit, purifié et caractérisé la phosphoprotéine du RABV et la forme soluble, monomérique de la nucléoprotéine du RABV en complexe avec un peptide de la phosphoprotéine. Nous avons montré que la phosphoprotéine du RABV seule était capable à des concentration de l’ordre de quelque mg.mL-1 d’induire une séparation de phase liquide-liquide réversible. Nous avons établi un diagramme de phase en fonction de la température, de la concentration de sel (NaCl) et de la concentration de protéine. Le diagramme est caractérisé par une température de solution critique inférieur (LCST) et montre que le processus est plus complexe qu’attendu pour un simple système binaire.Dans une solution diluée à haute concentration de sel (NaCl > 200 mM) et basse température (< 10°C), la phosphoprotéine du RABV forme des dimères, mais à plus haute concentration de protéine, température ou en variant la concentration de sel, elle forme des assemblages multimoléculaires solubles qui précédent la séparation de phase.Nous avons obtenu des profils de diffusion aux petits angles après centrifugation de la protéine dans la solution diluée et dans le condensat moléculaire. Nos données suggèrent que la séparation de phase liquide-liquide est induite par l’auto-coacervation de la phosphoprotéine, impliquant des interactions intra- et inter-moléculaires.