Engineering of fluorescent chemogenetic sensors for biomolecule detection and imaging

Ingénierie de senseurs chémogénétiques fluorescents pour la détection et l’imagerie debiomolécules. La détection optique et la quantification de biomolécules dans des échantillons biologiques nécessitent des systèmes robustes et spécifiques. Les biocapteurs fluorescents génétiquement encodés sont des outils prometteurs, car ils permettent généralement d'obtenir une grande sélectivité pour l'analyte sélectionné. Les biosenseurs sont généralement conçus en couplant un domaine de détection (par exemple un domaine de fixation d'un analyte ou un domaine de substrat enzymatique), capable de subir un important changement conformationnel dépendant d'un signal d'entrée, conjointement avec un module de signalisation fluorescent. Afin d'obtenir des biosenseurs avec un large spectre dynamique, nous proposons d'utiliser le fluorogen activating and absorption-shifting tag (FAST) comme module de signalisation. FAST est un marqueur fluorescent chemo-génétique inductible conçu à partir de la protéine jaune photoactive (photoactive yellow protein, PYP). Ses propriétés fluorescentes proviennent de la fixation réversible et sélective de chromophores fluorogènes. Des biosenseurs pour diverses biomolécules telles que le glutamate, l’ion potassium ou l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) ont été générés en couplant des variants de FAST avec différents domaines de détection. Ces développements nous ont permis de coupler la reconnaissance de l'analyte à la fixation du fluorogène, et donc à un changement de fluorescence. Le caractère hybride du module rapporteur a également permis d'obtenir un biosenseur avec une grande modularité, à la fois en termes de propriétés thermodynamiques et optiques. Dans un second temps, diverses permutations circulaires de FAST ont été explorées, et un nouveau site de fragmentation de l’étiquette protéique a été identifié. Cette étude a permis le développement et l'optimisation de nouveaux rapporteurs fluorescents, pouvant être utilisés pour la conception de biosenseurs. De plus, la nouvelle version d'un système splitFAST a permis de visualiser des interactions protéine-protéine avec un très haut contraste.