Functional characterization of intrinsically disordered regions in fungal LPMOs

Caractérisation fonctionnelle de régions intrinsèquement désordonnées chez les LPMOs fongiques Les « lytic polysaccharide monooxygenases » (LPMO) ont attiré une attention considérable en raison de leur importance dans les applications biotechnologiques et de leur rôle émergent dans de nombreux processus biologiques. Les LPMO sont des enzymes sécrétées regroupées en huit familles (AA9-11, AA13-17) dans la classe des enzymes à activité auxiliaire de la base de données CAZy. Ces enzymes catalysent le clivage oxydatif de différents polysaccharides récalcitrants (cellulose, chitine). La recherche sur les LPMO s'est principalement concentrée sur la fonction de leur domaine catalytique dans un contexte de bioraffinerie. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à leurs régions C-terminales dont la fonction est inconnue et négligée par la communauté. Les objectifs de ce travail ont été poursuivis par une combinaison d'approches interdisciplinaires. Une analyse bioinformatique portant sur 27 060 séquences de toutes les familles de LPMO a révélé que 60 % d'entre elles possèdent des régions C-terminales intrinsèquement désordonnées (dCTRs). La présence généralisée de dCTRs dans des LPMO provenant d'organismes très divergents sur le plan de l'évolution suggère un rôle fonctionnel. Les résultats de cette analyse bioinformatique ont permis de sélectionner des candidats fongiques au sein des familles de LPMO AA9 et AA14, en vue d'une caractérisation plus approfondie. Dans la famille AA9, la sélection des candidats LPMO-dCTRs du pathogène Colletotrichum orbiculare a été fondée sur la présence de courts motifs linéaires conservés (« SLiM ») à l'extrémité C-terminale. Nous avons découvert que le dCTR constitue un appendice flexible responsable de la dimérisation de la LPMO via un pont disulfure, une propriété jamais rapportée jusqu'à présent qui affecte positivement à la fois l’affinité pour la cellulose et l'activité de l’enzyme. Nous avons démontré que la délétion du gène entrave la formation de la cellule spécialisée dans l'infection (appressorium) et retarde la pénétration de la plante. Dans la famille AA14, particulièrement enrichie en dCTRs (57%), nous avons étudié la protéine AA14 du champignon de la pourriture blanche Pycnoporus coccineus (PcoAA14A). Nous avons montré que le dCTR de PcoAA14A est désordonné et glycosylé, et qu’il contribue à la stabilité de la protéine. Le dCTR de PcoAA14A et des peptides synthétiques correspondant à l’extrémité C-terminale sont capables de lier les ions cuivre et d'inhiber la croissance de certains champignons Basidiomycetes. Ces données révèlent que les dCTR des LPMO AA14 sont des régions fonctionnelles qui influencent la fonction de la protéine, probablement par le biais d'interactions avec les membranes et/ou les métaux. Dans l'ensemble, le travail réalisé dans cette thèse montre que les dCTRs ne sont pas des simples appendices dépourvus de fonction et contribue à une meilleure compréhension du rôle biologique des différentes familles de LPMO, ouvrant la voie à de nouvelles perspectives.