Site-directed nucleases as tools for genome editing in fish

Les nucléases ciblées comme outil d’édition du génome du poisson L'application des techniques de séquençage à haut débit dans les dernières années a conduit à l'obtention de la séquence de génomes complets de plusieurs organismes. Le développement de nouveaux outils de génétique inverse était donc souhaitable afin de faire un usage optimal des données accumulées. Les nucléases hautement spécifiques représentent un outil unique pour induire des modifications ciblées du génome in vivo. L'induction d'une cassure double brin dans l'ADN est réparée soit par la voie de jonction d’extrémités nonhomologues soit par la voie très fidèle de la recombinaison homologue. Le ciblage d'un locus précis avec une nucléase spécifique stimule fortement la réparation de l'ADN, qui peut être utilisé pour induire des modifications ciblées dans le génome. Dans ma thèse, je vise à fournir une preuve de prinicipe pour l'utilisation des méganucléases et des transcription activator like effector nucléases (TALENs), deux classes communes de nucléases très spécifiques, comme nouveaux outils d'édition du génome chez le medaka, Oryzias latipes, et le poisson zèbre, Danio rerio. J'ai d’abord trouvé les conditions optimales d'utilisation de ces nucléases dans nos modèles de poissons. J'ai à cette occasion également développé une méthode très sensible et rapide pour la détection de modifications génomiques ciblées. J'ai ensuite induit des mutations au sein de trois gènes différents chez le poisson zèbre avec des TALENs. Les mutations dans le gène col6a1 ont conduit à la mise en évidence pour la première fois d’une technique de modification d’un site d’épissage d’un gène de poisson zèbre à l’aide d’une nucléase ciblée. Ce travail nous a permis d’établir une lignée de poisson avec une mutation dans le collagène VI alpha 1 qui est similaire à une mutation fréquemment trouvée chez les patients humains atteints de myopathie de Bethlem. De même, j’ai pu induire des mutations dans le gène nle1 du poisson zèbre qui vont permettre la mise en place de lignées de poissons mutants de ce gène. En outre, j'ai pu montrer qu’un nouveau type de nucléase, une TALEN Compact, était actif sur une cible chromosomique chez le poisson zèbre. En conclusion, les études que j'ai effectuées ont apporté la preuve de principe pour l'activité de TALENs et Compact TALENs ainsi que la première démonstration de modification de l'épissage à l’aide d’une TALEN chez le poisson zèbre et ont abouti à la mise en place d'une lignée de poisson dont le phénotype est proche d’un syndrome humain ouvrant la voie à la création de modèles pour d’autres mutations de ce type. Pour finir, je discute dans cette thèse des conditions permettant un usage le plus efficace des nucléases ciblées pour la génération de mutants et l’édition du génome.